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.2007年9月24日；178（7）：1279-93。
doi:10.1083/jcb.200612053。 Epub 2007年9月17日。

RhoG调节ICAM1结合下游的内皮顶端杯组装，并参与白细胞跨内皮迁移

雅普·D·凡·布尔 1, 迈克尔·J·阿林厄姆, 托马斯·萨姆森, 朱莉娅·梅勒, 艾蒂安·博尔特, 拉斐尔·加西亚·马塔, 基思·伯里奇
附属公司

RhoG调节ICAM1结合下游的内皮顶杯装配，并参与白细胞跨内皮细胞迁移

雅普·D·凡·布尔等。 J细胞生物学. .

摘要

在跨内皮迁移（TEM）过程中，白细胞利用细胞间粘附分子-1（ICAM1）等粘附受体粘附在内皮上。作为对这种相互作用的反应，内皮细胞产生动态的膜突起，形成一个杯子，部分包围粘附的白细胞。关于调节杯子形成的信号通路，我们知之甚少。在这项研究中，我们发现RhoG在ICAM1参与的下游被激活。这种激活需要ICAM1的胞内结构域。ICAM1与RhoG共定位，并与含有RhoG特异性SH3的鸟嘌呤核苷酸交换因子（SGEF）结合。SGEF的SH3域介导了这种相互作用。小干扰RNA对内皮细胞RhoG的消耗不会影响白细胞粘附，但会减少杯状物的形成并抑制白细胞TEM。沉默SGEF还导致RhoG活性、杯子形成和TEM显著降低。总之，这些结果确定了一种新的信号通路，涉及ICAM1下游的RhoG及其交换因子SGEF，对白细胞TEM至关重要。

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数字

图1。
图1。
内皮细胞在粘附的HL60细胞周围突出ICAM1表达的膜皱褶。（A） TNF-α处理的内皮细胞与HL60细胞孵育30分钟，处理后，ICAM1染色为绿色，VE-cadherin染色为红色。共焦成像显示ICAM1在基底外侧焦平面（A）招募到白细胞粘附部位，并在顶部焦平面（b）形成围绕白细胞的环状结构。（B） Z-stack成像显示白细胞周围ICAM1染色呈绿色（a），而白细胞周围的F-actin染色呈红色（星号；B）。图c显示合并。Z堆栈成像重建显示ICAM1以杯状结构包围白细胞（绿色，d）。右侧的竖条显示突出物的高度（6μm）。（C） 瞬时转染GFP-actin的TNF-α处理的内皮细胞与HL60细胞孵育30分钟，处理并成像绿色（a和e）的GFP-action，红色（b和f）的ICAM1，黄色（C和g）的GFP-actin和ICAM1的合并，以及使用白色的指骨蛋白的f-actin，以可视化粘附的白细胞（d和h）。共焦成像显示，肌动蛋白和ICAM1被征募到白细胞粘附部位，围绕在白细胞顶部平面（e–h）。（D） 扫描电镜图像显示粘附的HL60细胞（星号）周围有突出的内皮膜片（箭头）。棒材（A），10μm；（B和C）5μm；（D） 1微米。
图2。
图2。
RhoG和SGEF在内皮细胞内生表达，定位于背侧内皮膜突起。（A） 对小鼠脑组织裂解物（SGEF阳性对照）、HUVECs、HeLa和COS7细胞的Western blot分析显示SGEF（100 kD；顶部blot）和RhoG（18 kD；底部blot）的内源性表达。（B） 用GFP–RhoG-Q61L（a）或GFP-SGEF（B）瞬时转染内皮细胞，并将F-actin染色为红色。图像显示合并。箭头显示膜皱褶。
图3。
图3。
SGEF和RhoG-Q61L与ICAM1共定位。（A） COS7细胞与ICAM1-GFP（A和g）或ICAM1-V5（d）以及GFP–RhoG-Q61L（e）或myc-SGEF（h）瞬时共转染。图b显示F-actin。图像c、f和i表示合并。ICAM1与RhoG-Q61L和SGEF共定位。此外，RhoG-Q61L和SGEF诱导ICAM1分布从尖峰（a）变为皱褶（箭头；d和g）。（B） COS7细胞与ICAM1-GFP（a和d）、myc-SGEF（B）或myc-RhoG-Q61L（e）瞬时共转染。面板c和f显示合并后的图像。共焦x-z截面图像显示ICAM1和SGEF（a–c）以及ICAM1与RhoG-Q61L（d–f）在背膜皱褶（箭头）中的共定位。棒材（A），20μm；（B） 10微米。
图4。
图4。
HL60细胞和涂有ICAM1抗体的珠招募ICAM1-GFP。（A） 用ICAM1-GFP（A）瞬时转染COS7细胞。让HL60细胞粘附30分钟。固定样品，使其渗透，并对其进行F-actin（b）染色。图c显示图像a和图像b的合并。请注意，大多数HL60细胞粘附在ICAM1-GFP表达细胞上。图d显示绿色ICAM1-GFP的x-z投影（箭头），围绕着用红色F-actin染色的粘附HL60细胞（星号）。（B）向表达ICAM1-GWP的COS7细胞添加αICAM1珠30分钟。用二级AlexaFluor594抗小鼠抗体对珠子进行红色染色（b）。图c显示了图像a和图像b的合并，以及白色的额外F-actin分布。注意，大多数αICAM1珠粘附在ICAM1-GFP表达细胞上。图d显示ICAM1-GFP的绿色x-z投影（箭头），围绕粘附的αICAM1珠子（星号）。（C） 扫描电镜图像显示围绕αICAM1珠（星号）的内皮膜片（箭头）。棒材（A和B，面板c），20μm；（A和B，面板d）5μm；（C） 1微米。
图5。
图5。
涂有ICAM1抗体的珠子将SGEF和活性RhoG招募到粘附部位。（A） 作为对照，单独表达GFP和ICAM1-V5的细胞用αICAM1珠培养。ICAM1单克隆抗体用于可视化ICAM1-V5。αICAM1珠用二级AlexaFluor抗体染色，二级AlexaFluor也将ICAM1染色为红色（a）。图像显示，粘附在ICAM1-V5（箭头；a–c）上的αICAM1珠子周围并没有单独招募GFP（绿色；b）。图c显示合并。图d显示图像c的放大。GFP-SGEF（f）和GFP-RhoG-Q61L（j）被招募（箭头）到表达COS7细胞（e和i）的ICAM1-V5上的αICAM1珠粘附位点。合并后的图像显示为g和k。图像h和l分别显示g和k的放大倍数。（B） 定量表达GFP的蛋白，这些蛋白被招募到由αICAM1微球诱导的粘附位点。所有细胞均转染ICAM1-V5，随后与GFP标记的蛋白共转染，但单转染的ICAM1-GFP除外。在55-80%的病例中，αICAM1微球将ICAM1-GFP、GFP-SGEF和GFP-RhoG-Q61L募集到粘附部位。相反，GFP、β-catenin–GFP和VE-cadherin–GFP未被招募。数据是至少四个独立实验的平均值±SEM（误差线）。棒材（A，面板c），10μm；（A，面板d、h和l）5μm；（A、g和k）20μm。
图6。
图6。
RhoG在ICAM1下游激活。（A） 使用腺病毒用myc RhoG wt瞬时转导HUVECs。按照材料和方法中的说明添加αICAM1珠。使用GST-ELMO，从裂解物中提取活化的RhoG，并通过使用抗myc抗体的蛋白质印迹分析进行检测。中间印迹显示内皮细胞裂解物中myc-RhoG-wt的蛋白表达水平。右边的图表显示了两个独立实验的量化。（B） 将αICAM1微球添加到TNF-α刺激的内皮细胞中，如材料和方法所述。使用GST-ELMO分离激活的内源性RhoG，并使用抗RhoG单克隆抗体进行Western blot分析。（A和B）αICAM1微球在30分钟内增加内皮细胞的RhoG活性（顶部）。底部面板显示内皮细胞裂解物中内源性ICAM1表达。（B） 中间的面板显示内皮细胞裂解物中内源性RhoG的表达水平。（C） 用myc-RhoG-wt和ICAM1-GFP瞬时转染COS7细胞。按照材料和方法中的说明添加αICAM1珠。使用GST-ELMO分离活化的RhoG，并使用抗myc抗体进行Western blot分析。αICAM1微球在30分钟内增加了RhoG活性（上图）。中间的面板显示了细胞裂解物中myc-RhoG-wt的表达水平。底部面板显示了细胞裂解物中抗GFP抗体检测到的ICAM1-GFP表达。（D） 实验按照B进行，但使用HL60细胞（5×105每六个孔的细胞数）。单转染myc-RhoG-Q61L-COS7细胞作为阳性对照。顶部面板显示HL60细胞粘附增加了RhoG-GTP水平。中间面板显示转染myc-RhoG-wt的水平，底部面板显示ICAM1-GFP的水平。（B–D）右侧的图表显示了三个独立实验的量化。数据为平均值±SEM（误差线）。*，P<0.05；**，P<0.01。
图7。
图7。
RhoG定位和激活需要ICAM1胞内结构域。（A） 用标记有V5（b）或ICAM1-V5的C末端缺失突变体（ICAM1-ΔC-V5；e）和GFP-RhoG-Q61L（A和d）的全长ICAM1瞬时共转染COS7细胞。面板c和f显示了相应的合并图像。ICAM1-ΔC-V5不与RhoG-Q61L共定位。（B） 除ICAM1-GFP已被V5标记ICAM1-wt（ICAM1-w t）或V5标记C末端截断ICAM1突变体（ICAM1-ΔC）取代外，实验如图6 C所示。顶部面板显示，ICAM1参与增加了表达ICAM1-wt的细胞中RhoG-GTP水平，但不增加表达ICAM1-ΔC的细胞中的RhoG-GTP水平。底部面板显示了总细胞裂解物中myc-RhoG-wt的水平。右边的图表显示了三个独立实验的量化。*，P＜0.05。（C） ICAM1细胞内尾部是粘附白细胞周围有效募集所必需的。共聚焦成像用于可视化表达ICAM1-wt或ICAM1-ΔC的COS7细胞的顶面和基底侧面。允许粘附30分钟的HL60细胞周围富含ICAM1的环的定量显示了ICAM1尾部对于适当的杯状物形成的要求。实验重复了三次，P<0.01。（B和C）数据为平均值±SEM（误差条）。棒材，20μm。
图8。
图8。
SGEF通过其SH3结构域与ICAM1的C末端结构域相互作用。（A） 使用抗ICAM1抗体对ICAM1进行免疫沉淀（IP），并使用IgG作为对照。抗SGEF抗体的免疫印迹显示内源性ICAM1和SGEF在内皮细胞中相互作用，而IgG没有显示与SGEF的任何相互作用（上图）。第二组显示，抗ICAM1抗体（左车道）可有效免疫沉淀ICAM1，而IgG（右车道）则无法有效免疫沉淀。两个底部面板显示内皮细胞裂解物中内源性SGEF和ICAM1的水平。（B） 用myc-SGEF-wt转染COS7细胞，进行裂解，然后用与ICAM1的胞内结构域（ICAM1-C-term.）或αv-整合素的胞内区域相对应的生物素化肽孵育，作为对照（αv-C-term）。基于链霉亲和素的下拉显示ICAM1的胞内结构域与myc-SGEF结合。右通道显示使用抗myc抗体的细胞裂解液总量的十分之一中myc-SGEF的表达。（C） 如B所述，对内皮细胞进行裂解，然后用生物素化肽孵育。顶部面板显示ICAM1肽结合内源性SGEF，而αv-C末端肽没有。（D，a）GST-SH3SGEF公司（氨基酸789–850）被纯化并与B中描述的肽孵育。使用链霉亲和素包衣的Sepharose珠进行下拉实验，并进行GST-SH3SGEF公司使用抗GST抗体检测。第3页SGEF公司与ICAM1尾部相互作用，但不与αv-整合素尾部相互作用（αv-C项）。（D，b）COS7细胞转染ICAM1-GFP和myc-SGEF-ΔDH或myc-SGEF-ΔSH3，并使用抗GFP抗体进行免疫沉淀处理。Western blot分析显示ICAM1-GFP与myc-SGEF结合，myc-SGEF含有SH3结构域，与DH结构域无关。（E） 用ICAM1-GFP和myc-SGEF-wt或myc-SGEF-W826R瞬时共转染COS7细胞。使用抗GFP抗体免疫沉淀ICAM1-GFP。抗myc抗体的免疫印迹显示SGEF-wt结合，但SGEF-W826R与ICAM1-GFP的结合减少（顶部）。底部印迹显示总细胞裂解物中免疫沉淀ICAM1-GFP和myc结构的水平，如图所示。（F） 用myc-SGEF-wt和ICAM1-wt-GFP或ICAM1-Δ脯氨酸（Pro）瞬时共转染COS7细胞。使用抗GFP抗体免疫沉淀GFP。抗myc抗体的免疫印迹显示SGEF-wt结合，但SGEF-w与ICAM1-ΔPro-GFP的结合减少（顶部）。底部印迹显示免疫沉淀ICAM1-wt-GFP或ICAM1-ΔPro-GFP以及GFP和myc构建物在总细胞裂解物中的水平，如图所示。请注意，ICAM1-ΔPro-GFP运行时略低于重量。
图9。
图9。
HL60细胞的迁移和杯状物的形成取决于RhoG的表达水平。（A） 抗RhoG的siRNA可有效降低内皮细胞内源性RhoG表达。长时间暴露确实显示出RhoG的一些表达。siRNA不影响RhoA、Rac1、Cdc42、微管蛋白、ICAM1或moesin的表达水平。（B） 根据材料和方法中的描述，对粘附的HL60细胞周围ICAM1阳性环的定量测定表明，当RhoG表达降低时，杯状结构显著减少，P<0.01。（C） 内皮细胞在transwell过滤器上培养，并用RhoG-siRNA转染，如材料和方法中所述。48小时后，分化的HL60细胞在自发条件下（黑条）或50 ng/ml SDF-1（白条）下迁移4小时。内皮细胞RhoG表达减少导致自发和SDF-1诱导的迁移减少。*，P<0.001；**，P<0.01。（B和C）实验重复四次。数据为平均值±SEM（误差线）。
图10。
图10。
减少HUVEC中SGEF的表达可阻断RhoG激活和TEM。（A） 抗SGEF的siRNA降低内皮细胞内源性SGEF表达。siRNA不影响内源性RhoG、Rac1、ICAM1或moesin的表达水平。（B） siRNA敲低SGEF表达抑制ICAM1下游RhoG的激活。用myc-RhoG-wt瞬时转导HUVEC并用TNF-α处理。siRNA降低了HUVEC中SGEF的表达，并使用GST-ELMO测定了αICAM1微球诱导的RhoG活性。顶部面板显示30分钟后RhoG活性，当SGEF表达降低时，RhoG活动被抑制（底部面板）。第二个面板显示了HUVEC中myc-RhoG-wt的相等表达。第三个面板显示细胞裂解物中ICAM1的水平相等。底部面板显示，经siRNA处理后，HUVEC中的SGEF表达降低。实验进行了两次。（C） SGEF表达的下调降低了ICAM1杯的形成。转染SGEF siRNA的内皮细胞与HL60细胞孵育。根据材料和方法中的描述，对粘附白细胞周围ICAM1阳性环的定量测量表明，当SGEF水平降低时，杯状结构显著减少。*，P<0.05。（D） SGEF表达下调抑制了迁移。内皮细胞在跨阱过滤器上培养并转染适当的siRNA，如材料和方法中所述。48小时后，分化后的HL60细胞在自发条件下（黑条）迁移4小时，或在下室（白条）向50 ng/ml SDF-1迁移。SGEF水平降低显著减少SDF-1诱导的迁移。*，P<0.001；**，P<0.05。（C和D）实验重复九次。数据为平均值±SEM（误差线）。
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