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.2007年9月24日;178(7):1279-93。
doi:10.1083/jcb.200612053。 Epub 2007年9月17日。

RhoG调节ICAM1结合下游的内皮顶端杯组装,并参与白细胞跨内皮迁移

附属公司

RhoG调节ICAM1结合下游的内皮顶杯装配,并参与白细胞跨内皮细胞迁移

雅普·D·凡·布尔等。 J细胞生物学. .

摘要

在跨内皮迁移(TEM)过程中,白细胞利用细胞间粘附分子-1(ICAM1)等粘附受体粘附在内皮上。作为对这种相互作用的反应,内皮细胞产生动态的膜突起,形成一个杯子,部分包围粘附的白细胞。关于调节杯子形成的信号通路,我们知之甚少。在这项研究中,我们发现RhoG在ICAM1参与的下游被激活。这种激活需要ICAM1的胞内结构域。ICAM1与RhoG共定位,并与含有RhoG特异性SH3的鸟嘌呤核苷酸交换因子(SGEF)结合。SGEF的SH3域介导了这种相互作用。小干扰RNA对内皮细胞RhoG的消耗不会影响白细胞粘附,但会减少杯状物的形成并抑制白细胞TEM。沉默SGEF还导致RhoG活性、杯子形成和TEM显著降低。总之,这些结果确定了一种新的信号通路,涉及ICAM1下游的RhoG及其交换因子SGEF,对白细胞TEM至关重要。

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数字

图1。
图1。
内皮细胞在粘附的HL60细胞周围突出ICAM1表达的膜皱褶。(A) TNF-α处理的内皮细胞与HL60细胞孵育30分钟,处理后,ICAM1染色为绿色,VE-cadherin染色为红色。共焦成像显示ICAM1在基底外侧焦平面(A)招募到白细胞粘附部位,并在顶部焦平面(b)形成围绕白细胞的环状结构。(B) Z-stack成像显示白细胞周围ICAM1染色呈绿色(a),而白细胞周围的F-actin染色呈红色(星号;B)。图c显示合并。Z堆栈成像重建显示ICAM1以杯状结构包围白细胞(绿色,d)。右侧的竖条显示突出物的高度(6μm)。(C) 瞬时转染GFP-actin的TNF-α处理的内皮细胞与HL60细胞孵育30分钟,处理并成像绿色(a和e)的GFP-action,红色(b和f)的ICAM1,黄色(C和g)的GFP-actin和ICAM1的合并,以及使用白色的指骨蛋白的f-actin,以可视化粘附的白细胞(d和h)。共焦成像显示,肌动蛋白和ICAM1被征募到白细胞粘附部位,围绕在白细胞顶部平面(e–h)。(D) 扫描电镜图像显示粘附的HL60细胞(星号)周围有突出的内皮膜片(箭头)。棒材(A),10μm;(B和C)5μm;(D) 1微米。
图2。
图2。
RhoG和SGEF在内皮细胞内生表达,定位于背侧内皮膜突起。(A) 对小鼠脑组织裂解物(SGEF阳性对照)、HUVECs、HeLa和COS7细胞的Western blot分析显示SGEF(100 kD;顶部blot)和RhoG(18 kD;底部blot)的内源性表达。(B) 用GFP–RhoG-Q61L(a)或GFP-SGEF(B)瞬时转染内皮细胞,并将F-actin染色为红色。图像显示合并。箭头显示膜皱褶。
图3。
图3。
SGEF和RhoG-Q61L与ICAM1共定位。(A) COS7细胞与ICAM1-GFP(A和g)或ICAM1-V5(d)以及GFP–RhoG-Q61L(e)或myc-SGEF(h)瞬时共转染。图b显示F-actin。图像c、f和i表示合并。ICAM1与RhoG-Q61L和SGEF共定位。此外,RhoG-Q61L和SGEF诱导ICAM1分布从尖峰(a)变为皱褶(箭头;d和g)。(B) COS7细胞与ICAM1-GFP(a和d)、myc-SGEF(B)或myc-RhoG-Q61L(e)瞬时共转染。面板c和f显示合并后的图像。共焦x-z截面图像显示ICAM1和SGEF(a–c)以及ICAM1与RhoG-Q61L(d–f)在背膜皱褶(箭头)中的共定位。棒材(A),20μm;(B) 10微米。
图4。
图4。
HL60细胞和涂有ICAM1抗体的珠招募ICAM1-GFP。(A) 用ICAM1-GFP(A)瞬时转染COS7细胞。让HL60细胞粘附30分钟。固定样品,使其渗透,并对其进行F-actin(b)染色。图c显示图像a和图像b的合并。请注意,大多数HL60细胞粘附在ICAM1-GFP表达细胞上。图d显示绿色ICAM1-GFP的x-z投影(箭头),围绕着用红色F-actin染色的粘附HL60细胞(星号)。(B)向表达ICAM1-GWP的COS7细胞添加αICAM1珠30分钟。用二级AlexaFluor594抗小鼠抗体对珠子进行红色染色(b)。图c显示了图像a和图像b的合并,以及白色的额外F-actin分布。注意,大多数αICAM1珠粘附在ICAM1-GFP表达细胞上。图d显示ICAM1-GFP的绿色x-z投影(箭头),围绕粘附的αICAM1珠子(星号)。(C) 扫描电镜图像显示围绕αICAM1珠(星号)的内皮膜片(箭头)。棒材(A和B,面板c),20μm;(A和B,面板d)5μm;(C) 1微米。
图5。
图5。
涂有ICAM1抗体的珠子将SGEF和活性RhoG招募到粘附部位。(A) 作为对照,单独表达GFP和ICAM1-V5的细胞用αICAM1珠培养。ICAM1单克隆抗体用于可视化ICAM1-V5。αICAM1珠用二级AlexaFluor抗体染色,二级AlexaFluor也将ICAM1染色为红色(a)。图像显示,粘附在ICAM1-V5(箭头;a–c)上的αICAM1珠子周围并没有单独招募GFP(绿色;b)。图c显示合并。图d显示图像c的放大。GFP-SGEF(f)和GFP-RhoG-Q61L(j)被招募(箭头)到表达COS7细胞(e和i)的ICAM1-V5上的αICAM1珠粘附位点。合并后的图像显示为g和k。图像h和l分别显示g和k的放大倍数。(B) 定量表达GFP的蛋白,这些蛋白被招募到由αICAM1微球诱导的粘附位点。所有细胞均转染ICAM1-V5,随后与GFP标记的蛋白共转染,但单转染的ICAM1-GFP除外。在55-80%的病例中,αICAM1微球将ICAM1-GFP、GFP-SGEF和GFP-RhoG-Q61L募集到粘附部位。相反,GFP、β-catenin–GFP和VE-cadherin–GFP未被招募。数据是至少四个独立实验的平均值±SEM(误差线)。棒材(A,面板c),10μm;(A,面板d、h和l)5μm;(A、g和k)20μm。
图6。
图6。
RhoG在ICAM1下游激活。(A) 使用腺病毒用myc RhoG wt瞬时转导HUVECs。按照材料和方法中的说明添加αICAM1珠。使用GST-ELMO,从裂解物中提取活化的RhoG,并通过使用抗myc抗体的蛋白质印迹分析进行检测。中间印迹显示内皮细胞裂解物中myc-RhoG-wt的蛋白表达水平。右边的图表显示了两个独立实验的量化。(B) 将αICAM1微球添加到TNF-α刺激的内皮细胞中,如材料和方法所述。使用GST-ELMO分离激活的内源性RhoG,并使用抗RhoG单克隆抗体进行Western blot分析。(A和B)αICAM1微球在30分钟内增加内皮细胞的RhoG活性(顶部)。底部面板显示内皮细胞裂解物中内源性ICAM1表达。(B) 中间的面板显示内皮细胞裂解物中内源性RhoG的表达水平。(C) 用myc-RhoG-wt和ICAM1-GFP瞬时转染COS7细胞。按照材料和方法中的说明添加αICAM1珠。使用GST-ELMO分离活化的RhoG,并使用抗myc抗体进行Western blot分析。αICAM1微球在30分钟内增加了RhoG活性(上图)。中间的面板显示了细胞裂解物中myc-RhoG-wt的表达水平。底部面板显示了细胞裂解物中抗GFP抗体检测到的ICAM1-GFP表达。(D) 实验按照B进行,但使用HL60细胞(5×105每六个孔的细胞数)。单转染myc-RhoG-Q61L-COS7细胞作为阳性对照。顶部面板显示HL60细胞粘附增加了RhoG-GTP水平。中间面板显示转染myc-RhoG-wt的水平,底部面板显示ICAM1-GFP的水平。(B–D)右侧的图表显示了三个独立实验的量化。数据为平均值±SEM(误差线)。*,P<0.05;**,P<0.01。
图7。
图7。
RhoG定位和激活需要ICAM1胞内结构域。(A) 用标记有V5(b)或ICAM1-V5的C末端缺失突变体(ICAM1-ΔC-V5;e)和GFP-RhoG-Q61L(A和d)的全长ICAM1瞬时共转染COS7细胞。面板c和f显示了相应的合并图像。ICAM1-ΔC-V5不与RhoG-Q61L共定位。(B) 除ICAM1-GFP已被V5标记ICAM1-wt(ICAM1-w t)或V5标记C末端截断ICAM1突变体(ICAM1-ΔC)取代外,实验如图6 C所示。顶部面板显示,ICAM1参与增加了表达ICAM1-wt的细胞中RhoG-GTP水平,但不增加表达ICAM1-ΔC的细胞中的RhoG-GTP水平。底部面板显示了总细胞裂解物中myc-RhoG-wt的水平。右边的图表显示了三个独立实验的量化。*,P<0.05。(C) ICAM1细胞内尾部是粘附白细胞周围有效募集所必需的。共聚焦成像用于可视化表达ICAM1-wt或ICAM1-ΔC的COS7细胞的顶面和基底侧面。允许粘附30分钟的HL60细胞周围富含ICAM1的环的定量显示了ICAM1尾部对于适当的杯状物形成的要求。实验重复了三次,P<0.01。(B和C)数据为平均值±SEM(误差条)。棒材,20μm。
图8。
图8。
SGEF通过其SH3结构域与ICAM1的C末端结构域相互作用。(A) 使用抗ICAM1抗体对ICAM1进行免疫沉淀(IP),并使用IgG作为对照。抗SGEF抗体的免疫印迹显示内源性ICAM1和SGEF在内皮细胞中相互作用,而IgG没有显示与SGEF的任何相互作用(上图)。第二组显示,抗ICAM1抗体(左车道)可有效免疫沉淀ICAM1,而IgG(右车道)则无法有效免疫沉淀。两个底部面板显示内皮细胞裂解物中内源性SGEF和ICAM1的水平。(B) 用myc-SGEF-wt转染COS7细胞,进行裂解,然后用与ICAM1的胞内结构域(ICAM1-C-term.)或αv-整合素的胞内区域相对应的生物素化肽孵育,作为对照(αv-C-term)。基于链霉亲和素的下拉显示ICAM1的胞内结构域与myc-SGEF结合。右通道显示使用抗myc抗体的细胞裂解液总量的十分之一中myc-SGEF的表达。(C) 如B所述,对内皮细胞进行裂解,然后用生物素化肽孵育。顶部面板显示ICAM1肽结合内源性SGEF,而αv-C末端肽没有。(D,a)GST-SH3SGEF公司(氨基酸789–850)被纯化并与B中描述的肽孵育。使用链霉亲和素包衣的Sepharose珠进行下拉实验,并进行GST-SH3SGEF公司使用抗GST抗体检测。第3页SGEF公司与ICAM1尾部相互作用,但不与αv-整合素尾部相互作用(αv-C项)。(D,b)COS7细胞转染ICAM1-GFP和myc-SGEF-ΔDH或myc-SGEF-ΔSH3,并使用抗GFP抗体进行免疫沉淀处理。Western blot分析显示ICAM1-GFP与myc-SGEF结合,myc-SGEF含有SH3结构域,与DH结构域无关。(E) 用ICAM1-GFP和myc-SGEF-wt或myc-SGEF-W826R瞬时共转染COS7细胞。使用抗GFP抗体免疫沉淀ICAM1-GFP。抗myc抗体的免疫印迹显示SGEF-wt结合,但SGEF-W826R与ICAM1-GFP的结合减少(顶部)。底部印迹显示总细胞裂解物中免疫沉淀ICAM1-GFP和myc结构的水平,如图所示。(F) 用myc-SGEF-wt和ICAM1-wt-GFP或ICAM1-Δ脯氨酸(Pro)瞬时共转染COS7细胞。使用抗GFP抗体免疫沉淀GFP。抗myc抗体的免疫印迹显示SGEF-wt结合,但SGEF-w与ICAM1-ΔPro-GFP的结合减少(顶部)。底部印迹显示免疫沉淀ICAM1-wt-GFP或ICAM1-ΔPro-GFP以及GFP和myc构建物在总细胞裂解物中的水平,如图所示。请注意,ICAM1-ΔPro-GFP运行时略低于重量。
图9。
图9。
HL60细胞的迁移和杯状物的形成取决于RhoG的表达水平。(A) 抗RhoG的siRNA可有效降低内皮细胞内源性RhoG表达。长时间暴露确实显示出RhoG的一些表达。siRNA不影响RhoA、Rac1、Cdc42、微管蛋白、ICAM1或moesin的表达水平。(B) 根据材料和方法中的描述,对粘附的HL60细胞周围ICAM1阳性环的定量测定表明,当RhoG表达降低时,杯状结构显著减少,P<0.01。(C) 内皮细胞在transwell过滤器上培养,并用RhoG-siRNA转染,如材料和方法中所述。48小时后,分化的HL60细胞在自发条件下(黑条)或50 ng/ml SDF-1(白条)下迁移4小时。内皮细胞RhoG表达减少导致自发和SDF-1诱导的迁移减少。*,P<0.001;**,P<0.01。(B和C)实验重复四次。数据为平均值±SEM(误差线)。
图10。
图10。
减少HUVEC中SGEF的表达可阻断RhoG激活和TEM。(A) 抗SGEF的siRNA降低内皮细胞内源性SGEF表达。siRNA不影响内源性RhoG、Rac1、ICAM1或moesin的表达水平。(B) siRNA敲低SGEF表达抑制ICAM1下游RhoG的激活。用myc-RhoG-wt瞬时转导HUVEC并用TNF-α处理。siRNA降低了HUVEC中SGEF的表达,并使用GST-ELMO测定了αICAM1微球诱导的RhoG活性。顶部面板显示30分钟后RhoG活性,当SGEF表达降低时,RhoG活动被抑制(底部面板)。第二个面板显示了HUVEC中myc-RhoG-wt的相等表达。第三个面板显示细胞裂解物中ICAM1的水平相等。底部面板显示,经siRNA处理后,HUVEC中的SGEF表达降低。实验进行了两次。(C) SGEF表达的下调降低了ICAM1杯的形成。转染SGEF siRNA的内皮细胞与HL60细胞孵育。根据材料和方法中的描述,对粘附白细胞周围ICAM1阳性环的定量测量表明,当SGEF水平降低时,杯状结构显著减少。*,P<0.05。(D) SGEF表达下调抑制了迁移。内皮细胞在跨阱过滤器上培养并转染适当的siRNA,如材料和方法中所述。48小时后,分化后的HL60细胞在自发条件下(黑条)迁移4小时,或在下室(白条)向50 ng/ml SDF-1迁移。SGEF水平降低显著减少SDF-1诱导的迁移。*,P<0.001;**,P<0.05。(C和D)实验重复九次。数据为平均值±SEM(误差线)。

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