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。2007年9月19日；26(18):4138-48.
doi:10.1038/sj.emboj.7601824。 Epub 2007年8月30日。

克鲁珀样因子KLF4是单核细胞分化的关键调节因子

马克·范伯格 1, Akm Khyrul瓦拉, 曹卓雄, 玛丽亚·列贝德娃, 弗兰克·罗森鲍尔, 岩崎裕美, Hideyo Hirai先生, 乔纳森·P·卡茨, 理查德·哈斯佩尔, 苏珊·戈瑞, 明石光一, 朱莉·塞格尔, 克劳斯·凯斯特纳, 丹尼尔·特南, 穆克什·K·贾恩
附属公司

克鲁珀样因子KLF4是单核细胞分化的关键调节因子

马克·范伯格等。 欧洲工商管理硕士J。 。

摘要

单核细胞分化涉及谱系限制性转录因子的参与，尽管这一过程发生的机制尚未完全确定。在造血系统中，克鲁珀样因子家族（KLFs）的成员在红细胞和T淋巴细胞发育中起着重要作用。这里我们显示，在骨髓生成过程中，KLF4/GKLF以单核细胞限制和阶段特异性模式表达，并发挥促进单核细胞分化的作用。KLF4在HL-60细胞中的过度表达具有成熟单核细胞的特征。相反，KLF4基因敲除阻断了佛波酯诱导的单核细胞分化。在克隆形成分析中，KLF4在原发性普通髓系祖细胞（CMP）或造血干细胞（HSC）中的强制表达可诱导单核细胞分化，而KLF4缺乏可抑制单核细胞，但增加粒细胞分化。机理研究表明KLF4是PU.1的靶基因。KLF4可以沿着单核细胞系拯救PU.1-/-胎儿肝细胞，并激活单核细胞特异性CD14启动子。因此，KLF4是转录网络中控制单核细胞分化的关键调节因子。

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数字

图1
图1
KLF4在人单核细胞、造血细胞系以及单核细胞和粒细胞分化过程中的表达。(A类)KLF4的Northern blot分析显示了单核细胞富集的表达模式。检测的细胞类型为人类外周血单核细胞（1°单核细胞）、THP-1（单核细胞白血病）、U-937（组织细胞白血病），HeL（红细胞）、Jurkat（T细胞）、Raji（未成熟B细胞）和U-266（成熟B细胞。(B类)人单核细胞和人髓细胞系中KLF4蛋白表达的Western blot分析。(C类)HL-60细胞的Northern blot分析显示，KLF4在TPA分化的单核细胞中表达，但在RA-分化的粒细胞中不表达，而CD11b在两种细胞类型中都表达。
图2
图2
HL-60细胞中KLF4的逆转录病毒过表达促进了成熟单核细胞的特征。按照材料和方法中的描述，用空病毒对照物或KLF4构建物逆转录病毒感染HL-60细胞。(A类)Northern blot分析表明，KLF4过表达能够诱导一些髓系分化标记物，如CD11b、CD14、PU.1和c-fms。KLF4（exo）是外源性KLF4 mRNA表达。(B类)外源性KLF4蛋白的Western blot分析。(C类)对EV或KLF4转导的细胞进行FACS分析，并显示骨髓分化标志物CD11b的高诱导（81.7%对2.6%；P（P）<0.00002）和CD14（75.8 vs 6.5%；P（P）<0.00003）对KFL4过度表达的反应。使用CD66b（粒细胞）、CD3（T淋巴细胞）或CD19（B淋巴细胞）抗体没有差异。(D类)来自三个独立实验的EV或KLF4过度表达细胞中每个标记物的阳性百分比。(E类)用Wright–Giemsa染色法对EV或KLF4过度表达的HL-60细胞的胞浆制剂进行染色，并在×100处观察。(F类)KLF4敲除抑制HL-60 TPA诱导的单核细胞分化。将HL-60细胞与KLF4或非特异性（NS）对照物特异的吗啉寡核苷酸孵育，然后在TPA（100 ng/ml）存在下分化48小时(G公司)KLF4敲除后粘附和分化的HL-60细胞显著减少（约5倍，右）。NS或AS-KLF4孵育后HL-60细胞的光学显微镜（左，×100），如图F所示(H（H）)EV或KLF4感染细胞的生长速度在6天内计数。(我)对过度表达EV或KLF4的细胞进行DNA含量分析。(J型)Northern blot分析表明KLF4诱导p21WAF1（加权平均1）并抑制细胞周期蛋白D1。EtBr、溴化乙锭。
图3
图3
KLF4反式激活单核细胞CD14启动子并通过KLF位点与DNA结合。用0.5μg pcDNA3或KLF4以及各自的启动子荧光素酶报告子构建物在HeLa细胞中进行瞬时转染实验。校正β-半乳糖苷酶后，报告相对荧光素酶值。(A类)KLF4诱导CD14启动子，而抑制非髓系平滑肌（SM）α-肌动蛋白启动子。(B类)进行瞬时转染研究，比较KLF4、仅KLF4 DNA-结合域（ZnF-KLF4）和其他几个KLF家族成员（KLF2、KLF5和KLF15）。只有全长KLF4而非其他KLF可以对单核细胞CD14启动子进行私有化。(C类)近端和远端KLF位点的缺失导致CD14启动子的KLF4诱导显著减少。(D类)使用GST或GST-KLF4-Flag纯化蛋白在近端和远端KLF-DNA结合位点上进行电泳迁移率变化分析（EMSA）。KLF4的特定带（箭头）表明仅与包含野生型KLF近端（−92至−82）或远端（−288至−278）位点的放射性标记寡核苷酸探针结合，但不与突变位点结合，并且在存在α-Flag抗体的情况下可能发生超移位。
图4
图4
强制KLF4指示CMP优先诱导单核细胞分化。(A类)髓系分化过程中内源性KLF4的阶段特异性表达。对小鼠骨髓源性骨髓祖细胞（HSC，造血干细胞；CMP，普通髓系祖细胞；GMP，粒细胞-巨噬细胞祖细胞；MEP，巨核细胞-红细胞祖细胞）进行KLF4（左）或PU.1（右）的qPCR分析。(B类——F类)CMPs或HSC的转导。分离骨髓源CMP或HSC，用对照（EV）、KLF4或PU.1逆转录病毒转导，分类GFP阳性，并在甲基纤维素集落分析中评估分化。大约3-5%的细胞为GFP阳性（B）。（C） CMP中KLF4过度表达对基于形态学鉴定的各种造血谱系的影响。对照逆转录病毒感染的细胞显示了所有不同髓系的谱，而KLF4过度表达的细胞显示出主要的单核细胞分化。（D） KLF4过表达CMPs的形态学。光镜（顶部）和赖特-吉姆萨染色（底部）显示，KLF4转导的细胞表现出单核细胞的形态学特征。（E） CMP中PU.1过度表达促进单核细胞和粒细胞分化。（F） HSC中KLF4过度表达促进单核细胞分化，而PU.1促进单核和粒细胞分化。数据代表了三个独立实验，得到了相同的结果。
图5
图5
KLF4拯救PU.1完整细胞中的单核细胞分化，是PU.1的靶基因。(A类)Northern和Western blot分析显示PU.1−/−胎肝细胞中KLF4表达缺失（Anderson等，20011999）与野生型（WT）巨噬细胞相比。(B类)逆转录病毒KLF4在PU.1−/−胎肝细胞中的过度表达诱导骨髓分化标记物CD11b和CD45达到PU.1本身的水平。(C类)半定量RT-PCR分析表明，KLF4过表达细胞表达M-CSFR而非G-CSFR。相反，PU.1过表达细胞诱导M-CSFR和G-CSFR。HPRT显示为加载控件。(D类)HL-60细胞PU.1过度表达的Northern blot分析可诱导KLF4 mRNA表达。EtBr、溴化乙锭。(E类)PU.1诱导−1.0 kb KLF4启动子～15倍，而假定的PU.1 DNA结合位点突变显著降低PU.1反式激活。(F–G公司)PU.1可以与KLF4启动子中的PU.1位点结合，这已被（F）电泳迁移率转移分析（EMSA）和ChIP研究（G）证实。
图6
图6
CMP或HSC中KLF4缺乏降低单核细胞并增加粒细胞分化。(A类——D类)Klf4loxP小鼠CMP或HSC的克隆形成分析。用携带Cre重组酶或EV（Ctrl）的逆转录病毒转导CMP。逆转录病毒感染36小时后分离出GFP阳性的CMP或HSC，并进行7天的甲基纤维素检测。Cre介导的KLF4切除（B，D）对应于单核细胞减少和粒细胞增加（a，C）。数据代表了三个独立实验，得到了相同的结果。
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