Plasticity of polyubiquitin recognition as lysosomal targeting signals by the endosomal sorting machinery

doi:10.1091/mbc.e07-07-0678

.2007年10月；18(10):3952-65.

doi:10.1091/mbc.e07-07-0678。 Epub 2007年8月8日。

内胚体分选机对多泛素识别为溶酶体靶向信号的可塑性

赫夫·巴里埃¹, Csilla Nemes公司, 开都, Gergely L Lukacs公司

附属公司

PMID： 17686993
预防性维修识别码：项目经理1995726
内政部： 10.1091/mbc.e07-07-0678

内胚体分选机对多泛素识别为溶酶体靶向信号的可塑性

赫夫·巴里埃等。分子生物学细胞. 2007年10月.

.2007年10月；18(10):3952-65.

doi:10.1091/mbc.e07-07-0678。 Epub 2007年8月8日。

作者

赫夫·巴里埃¹, Csilla Nemes公司, 开都, Gergely L Lukacs公司

附属

¹加拿大安大略省多伦多市多伦多大学生物化学、实验室医学和病理生物学系病童研究所医院，M5G 1X8。

PMID： 17686993
预防性维修识别码：项目经理1995726
内政部： 10.1091/mbc.e07-07-0678

摘要

溶酶体靶向是调控细胞表面泛素化膜蛋白处置的基础。为了阐明作为多泡体（MVB）/溶酶体分选基序所必需和充分的泛素（Ub）构型，测定了带有单泛素化、多单泛素化或多泛素化细胞质尾部的模型跨膜货物分子的内体目的地和转运动力学。带有K63连锁多-Ub链的单体CD4嵌合体和四体CD4-mono-Ub嵌合体快速靶向溶酶体。相反，暴露K48连锁Ub链的CD4嵌合体的溶酶体传递延迟，而单泛素化CD4嵌体的传递则无法检测到。在单/多泛素化不变链和通过MARCH（膜相关环-CH）IV Ub连接酶泛素化CD4的溶酶体靶向方面也观察到类似的差异。与此相一致的是，Hrs（肝细胞生长因子调节酪氨酸激酶磷酸化底物）是一种内体分选适配器，优先与K63-Ub链结合，而与单-Ub结合则可以忽略不计。这些结果突显了Ub作为分选信号的可塑性以及内胚体分选机对其的识别，并结合以前的数据，表明溶酶体货物分选中特定拓扑结构的Ub链的组装和拆卸具有调控作用。

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数字

**图1。**
CD4-Ub嵌合体的表达和稳定性。（a） CD4-Ub嵌合体的示意图。CD4的细胞质尾部被柔性连接子（CD4Tl）或四聚螺旋结构域（CD4cc）和所示的Ub部分取代，如*材料和方法*（b）CD4Tl-Ub的多泛素化。将表达所示CD4嵌合体的COS-7瞬时细胞与OKT4抗CD4抗体在37℃孵育30分钟。CD4-Ab复合物在蛋白G珠上进行免疫分离。用HRP-结合的P4D1抗Ub抗体检测免疫沉淀物。（c）在瞬时转染的HEK293细胞中用100μg/ml环己酰亚胺（CHX）抑制翻译后，测量CD4嵌合体的代谢稳定性。追踪后，用抗CD4抗体对等量的细胞裂解物进行免疫印迹。CD4Tl-Ub泛素化用星号（*）表示。（d） CD4-Ub嵌合物的降解动力学通过面板c中所示免疫印迹的密度测定法测定。数据为平均值±SEM；n=3-4。（e）抑制溶酶体蛋白水解和货物运输可稳定CD4Tl-Ub和CD4cc-UbRΔG。在CHX追踪6小时后，在面板c中所述的bafilomycinA1（1μM）、MG132（20μM）或leupeptin+胃蛋白酶抑制素（5–5μg/ml）存在下测量CD4-Ub嵌合体的稳定性。（f）对CD4Tl、CD4Tl-Ub和CD4cc-UbRΔG免疫印迹进行密度分析，如面板e所示。使用10μM的乳酸菌素。数据表示为初始货物量的百分比。平均值±SEM；n=3。

**图2。**
CD4-Ub嵌合体的稳定性、内化和再循环。（a）通过瞬时转染COS-7细胞中细胞表面结合的抗CD4抗体的消失来监测嵌合体质膜池的周转。在冰上用抗CD4抗体标记细胞1小时，然后在37°C下追踪0.5–20小时。如中所述，在HRP-共轭二级抗体和AmplexRed存在的情况下，通过荧光法测量留在细胞表面的抗体*材料和方法*.对细胞蛋白的荧光进行了标准化。平均值±SEM；n=3。（b） CD4-Ub嵌合体的内化率。嵌合体的内分泌速率通过COS-7细胞中的抗CD4 Ab摄取来测量，如*材料和方法。*数据以细胞表面CD4-Ub嵌合体初始数量的百分比表示。平均值±SEM；n=3–5。（c）使用生物素-链霉亲和素夹心技术在瞬时转染的COS-7细胞中测量嵌合体的回收效率，如*材料和方法*回收率表示为内部化货物的百分比。平均值±SEM；n=3–5。

**图3。**
内化CD4-Ub嵌合体的亚细胞定位。（a）内部化的CD4Tl-Ub和CD4cc-UbRΔG与溶酶体共定位，避免了HEK293细胞中内体的再循环。嵌合体被抗CD4抗体和FITC-共轭二级Fab内吞。溶酶体和再循环内体分别用FITC-右旋糖酐和TRITC-Tf标记。通过免疫染色将内化右旋糖酐与Lamp1共定位（数据未显示）。用激光共聚焦荧光显微镜获得单个光学切片。棒材，10μm。（b）内部化的CD4Tl和CD4Tl-UbRΔG与再循环内体共定位，并从溶酶体中排除。循环内体、溶酶体和CD4嵌合体的染色如图a所示。Bar，10μm。

**图4。**
通过水泡pH值（pH）监测内部货物分拣_v（v）)测量。（a） pH值验证_v（v）通过监测HEK293细胞中的转铁蛋白（Tf）、表皮生长因子（EGF）和右旋糖酐分选进行测量。FITC-右旋糖酐和FITC-Tf的加载协议如所述*材料和方法。*血清耗尽的细胞内化生物素-EGF和FITC-链霉亲和素1小时，并在37°C下追逐2小时。pH值_v（v）在COS-7（右旋糖酐）细胞中也得到了类似的结果。平均（±SEM）pH_v（v）并指出了单个实验中分析的囊泡数量。平均pH值_v（v）补充表S1总结了≥3个独立实验。（b） CD4Tl-Ub溶酶体递送动力学。抗CD4抗体和FITC缀合的二级Fab在0°C下与转染的HEK293细胞结合1小时。然后将温度升高到37°C，持续1、15或30分钟，并将pH值_v（v）（c）表达CD4Tl-和CD4T1-Ub-的HEK293细胞可以在37°c下内化抗CD4初级抗体和FITC-结合次级Fab 1小时，并在FRIA前追赶30分钟。在COS-7细胞中也获得了类似的结果（数据未显示）。

**图5。**
CD4-Ub嵌合体的溶酶体分选需要多聚-Ub或多分-Ub。（a）如图4c所示，通过FRIA监测COS-7细胞中所示CD4嵌合体的内吞后分选。数据表示为pH频率_v（v）和pH值的平均值_v（v）±单个实验的SEM（另见补充表S1）。（b）不变链-Ub嵌合体的溶酶体分类。缺失其内化基序的截短不变链（IiT）、IiT-Ub和IiT-UbRΔG的细胞后转运由pH值决定_v（v）使用一级抗-Ii和FITC共轭二级Fab片段与FRIA进行测量，如*材料和方法。*（c） pH值_v（v）如图4c所示，测量了内含CD4cc-、CD4cc-Ub-和CD4cc-UbRΔG的内化囊泡。（d） ●●●●。CD4Tl和CD4Tl-UbRΔG的多重聚合是通过在冰上依次与抗CD4抗体（OKT4）、生物素化次级抗体和链霉亲和素FITC孵育细胞来实现的。在37°C的无抗体培养基中开始内化30分钟，pH_v（v）通过FRIA测定。（e）通过pH值确定CD4cc-UbRI44A和CD4cc-UbR的后核分选_v（v）测量值如面板a所示。

**图6。**
E1酶失活会损害CD4Tl-Ub的Ub链形成和溶酶体分选，但不会损害CD4cc-UbRΔG。（a） E1酶的热失活在40°C的ts20中完成，但在E36细胞中未完成。使用ECL用抗E1抗体探测等量的细胞裂解物。（b）表达所示结构的Ts20和E36细胞在40°C下培养3小时，以下调E1 Ub激活酶。pH值_v（v）通过FRIA测定了内吞CD4Tl-Ub和CD4cc-UbRΔG。

**图7。**
Ub链构型对CD4-Ub嵌合体内化和细胞后分选的影响。（a）如图4c所示，FRIA监测瞬时转染COS-7细胞中CD4Tl-UbRΔG6K、-UbR△G29K、-UbR△G48K和-UbRδG63K的后核分选。显示较大pH值队列的囊泡_v（v）有灰色阴影。（b）用HA标记的Ub变异体瞬时转染COS-7细胞的免疫印迹分析。用SDS-PAGE分离等量的细胞裂解物，并用抗HA抗体进行检测。（c）UbR的瞬时共表达，而不是wt-Ub，可防止CD4Tl-Ub的溶酶体积聚。通过pH值监测嵌合体的细胞后命运_v（v）如图4c所示，在COS-7细胞中，以1:3–4的质粒比例瞬时共表达CD4TlUb和Ubs变体。（d）在UbR63K或UbR48K过度表达的情况下，通过pH值监测CD4Tl-Ub的细胞后分选_v（v）如有必要，追踪时间延长至90分钟。在稳定表达CD4Tl-Ub的HEK293细胞中，并以10:1的比例转染编码Ub变体和dsRed荧光蛋白的质粒，获得了类似的结果。对表达dsRed的细胞进行FRIA。（e） Ub变异体过度表达时CD4Tl-Ub的内化率。通过抗CD4抗体摄取试验测量瞬时共转染COS-7细胞的内吞率，如*材料和方法。*平均值±SEM；n=3*相对于模拟转染的CD4Tl-Ub，p>0.05。

**图8。**
内源性和重组Hrs的Ub结合特异性。（a）HEK293细胞中Hrs与CD4Tl-Ub的关联。用OKT4抗CD4抗体检测免疫沉淀的CD4Tl-Ub和指示的抗体。加载100微克裂解物（lys）。（b）用HeLa细胞裂解液培养等量的含有一个、两个、三个或四个串联Ubs的GST融合蛋白，如*材料和方法*用免疫印迹法观察结合小时（顶面）和E1 Ub激活酶（中面）。GST-2Ub的突变变异体描述于*材料和方法。*装载10%的裂解物（lys）。通过Ponceau染色观察GST-Ub融合（底部面板）。（c） K63链接的Ub链与重组Hrs的优先结合。类似数量的MBP、wt或突变的MBP-Hrs融合蛋白与直链淀粉珠结合，并与K48-（左面板）、K63链接聚-Ub链（中面板）或单-Ub（右面板）孵育。使用P4D1抗Ub抗体通过免疫印迹法显示结合的Ub。根据*材料和方法*.

**图9。**
CD4-1K溶酶体靶向需要多泛素化。（a）通过FRIA监测瞬时转染COS-7细胞中存在或不存在MARCH-IV和wt-Ub时CD4-1K和CD4-4R的细胞后分选。将Abs内化1.5小时，并在指定的时间内追赶。（b）如面板a所述，在存在MARCH-IV和UbR、UbR63K或UbR48K的情况下监测CD4-1K的后细胞分选。追踪时间为45或90分钟。

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