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.2007年8月3日；27(3):380-92.
doi:10.1016/j.molcel.2007.05.041。

转录因子的层级网络控制雄激素受体依赖性前列腺癌的生长

王千本 1, 魏丽, X雪莉·刘, 杰森·S·卡罗尔, 奥利·阿贾纳, 艾瑞卡·克拉斯尼卡斯·基顿, 阿鲁尔M钦奈扬, 肯尼思·皮恩塔, 迈尔斯·布朗
附属公司

转录因子的层级网络控制雄激素受体依赖性前列腺癌的生长

王千本等。 分子电池. .

摘要

雄激素受体（AR）是一种配体依赖性转录因子，在前列腺癌中起关键作用。对于人类基因组中AR顺调控位点的性质知之甚少。我们通过结合染色质免疫沉淀（ChIP）和拼接寡核苷酸微阵列，在人类前列腺癌细胞的两条染色体上定位AR结合区域。我们发现大多数AR结合区域都含有非经典的AR反应元件（ARE）。重要的是，我们确定了一种非经典ARE作为TMPRSS2中AR作用的顺调节靶点，TMPRSS1是一种在大多数前列腺癌中与ETS转录因子融合的基因。此外，通过丰富的DNA-结合基序的存在，我们发现其他转录因子包括GATA2和Oct1在介导雄激素反应中起协同作用。这些协同因子与AR一起形成了一个调控层级，调控雄激素依赖性基因的表达和前列腺癌的生长，并为治疗干预提供了潜在的新机会。

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数字

图1
图1。人类21号和22号染色体AR结合位点图谱
RefSeq基因显示在暗条中，AR结合区显示为蓝色条。指出了进一步详细分析的十个结合区域。
图2
图2。21号和22号染色体AR结合位点的特征
（A） 对各种潜在AR结合区域AR招募的标准ChIP分析。用100 nM DHT处理LNCaP细胞1或16小时。用抗AR抗体进行ChIP分析。使用跨越不同潜在AR结合区域的引物（表S1）通过实时PCR定量免疫沉淀DNA。（B和C）DHT浓度对AR与染色质结合和细胞增殖的影响。（B） 用1、10或100 nM DHT处理雄激素缺失的LNCaP细胞1小时。用抗AR抗体进行ChIP分析，并使用横跨PSA增强子和B39位点的引物用实时PCR测定DNA沉淀物。（C） LNCaP细胞在激素缺失培养基中培养3天，然后用0.1到1000 nM的载体或DHT再处理3天。使用WST-1分析测定细胞增殖。（D） 不同潜在AR结合区域Pol II招募的标准ChIP分析。用抗Pol II抗体进行ChIP测定。（E） AR结合位点和21号染色体和22号染色体基因组背景中AR结合基序类型的分布。（F） AR结合区起增强子的作用。将10个选择的AR结合区、带有缺失ARE的突变AR结合区（B21和B39）和FKBP5增强子亚克隆到pGL3-启动子载体中，并转染到雄激素缺失的LNCaP细胞中。使用空的pGL3启动子载体作为阴性对照。用100 nM DHT或载体刺激细胞24小时。数据表示为两到三个重复（A）-（D）和（F）的平均±SE。
图3
图3。TMPRSS2调节区特征
（A） VCaP细胞中PSA和B39上AR占用率的ChIP分析。VCaP细胞（一种表达TMPRSS2:ERG公司融合基因）用100 nM DHT处理1小时。用抗AR抗体进行ChIP分析。（B） TMPRSS2增强子和启动子之间的空间通信。使用来自载体或DHT处理的LNCaP细胞的固定或EcoRI或BtgI消化染色质进行5C。连接后，使用位于-13.5 kb或462 kb AR结合区和-700 bp启动子区两侧的引物（表S1）PCR扩增DNA。在限制性内切酶消化之前，使用染色质进行对照PCR。（C） TMPRSS2 14 kb上游监管区域示意图。显示了潜在的五个ARE簇和十四个1kb片段。（D） 五个潜在ARE地区AR招募的ChIP分析。使用载体或100 nM DHT处理4或16小时的LNCaP细胞中的抗AR抗体进行ChIP分析。（E）TMPRSS2 14 kb上游调控区内增强子元件的系统定位。将14个1 kb TMPRSS2上游序列亚克隆到pGL3-启动子载体并转染到LNCaP细胞。用载体或100 nM DHT处理细胞24小时。数据表示为两到三个重复（A）、（D）和（E）的平均±SE。
图4
图4。协同转录因子被招募到AR结合区
（A） AR结合区域内AR半位点和转录因子基序关联的示意图。每个成对的关联都由一个不同颜色的圆圈指定。圆圈的面积与关联的频率成正比。（B） 向AR结合区域招募合作因素。LNCaP细胞在激素缺失培养基中培养3天，然后用载体或DHT处理1和16小时。然后用指示的抗体或对照IgG进行ChIP分析。使用横跨PSA增强子和染色体21和22上九个AR结合区的引物，通过实时PCR检测DNA沉淀物。结果显示为两到三个重复±SE的平均值。还显示了are、Forkhead、GATA和Oct基序在每个区域的出现情况。
图5
图5。AR在体内与协同转录因子相互作用
（A） AR与其协同因子在体内共免疫沉淀。LNCaP细胞在DHT存在或不存在的情况下培养24小时。用指示抗体或对照IgG免疫沉淀（IP）全细胞裂解物。用所示抗体进行Western blot（WB）。（B） 染色质上形成AR协同因子复合物。LNCaP细胞用或不用DHT处理16小时。用抗AR抗体进行ChIP测定。洗脱免疫沉淀染色质，用指示的抗体或对照IgG重新沉淀，并使用PSA和B38增强子区域两侧的引物通过PCR扩增。（C和D）Colocalized顺式-活性元素是AR依赖性转录所必需的。将PSA增强子或启动子区域（C）或B39报告子野生型构建物和带有缺失GATA或Oct基序的野生型PSA报告子构建物以及带有GATA或O ct基序缺失的B39报告分子（D）转染到经载体或100 nM DHT处理24小时的LNCaP细胞中。测定了荧光素酶活性，结果显示为三次试验的平均值±SE。
图6
图6。协同转录因子在介导AR-依赖性转录中的功能分析PSA公司和TMPRSS2型基因
（A） RNAi抑制AR协同因子水平。用靶向每个因子的siRNA和对照siRNA转染LNCaP细胞。转染后48小时，用或不用100 nM DHT处理细胞16小时，并用所示抗体进行免疫印迹。（B） siRNA对PSA公司,TMPRSS2型、和GADPH公司基因表达。siRNA转染48小时后，用或不用1或100 nM DHT处理细胞4小时和16小时。使用转录特异性引物通过实时RT-PCR分离和扩增总RNA（表S1）。在4小时时测量非阳性对照。（C）沉默GATA2和Oct1对AR、Pol II、Oct1和GATA2向PSA和TMPRSS2增强子募集的影响。在载体或4小时100 nM DHT处理siLuc、siGATA2或siOct1转染细胞后，进行AR、Pol II、Oct1和GATA2 ChIP。两到三个独立实验的平均值±SE的图形表示如（B）和（C）所示。
图7
图7。协同转录因子在介导第9页基因转录与前列腺癌细胞增殖
（A） AR结合位点相对于PDE9A型基因。黑色方块代表AR结合位点。这个PDE9A型基因显示为5′-3′方向，蓝色箭头表示基因的方向（6月5日，加州大学圣克鲁斯分校[UCSC]，已知基因）。（B） FoxA1、GATA2和Oct1沉默对PDE9A mRNA表达的影响。siRNA-RTPCR分析如图6B所示。（C） 沉默GATA2和Oct1对PDE9A增强子AR、Pol II、Oct1和GATA2募集的影响。如图6C所示进行siRNA ChIP分析。（D） AR和辅因子沉默对雄激素刺激的细胞周期进入的影响。siRNA转染48小时后，用或不用1或10 nM DHT处理细胞24小时。然后固定细胞，用碘化丙啶染色，并用流式细胞术进行分析。数值表示两到三个独立实验（B）到（D）的平均值±SE。
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