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.2007年9月14日；372(2):298-316.
doi:10.1016/j.jp.2007.06.079。 Epub 2007年7月3日。

F9胚胎癌细胞中转录共调节因子和多梳组蛋白SUZ12与Hoxa1、RARbeta（2）和Cyp26A1的维甲酸反应元件的维甲酸调节相关性

罗伯特·F·吉莱斯皮 1, 洛林·J·古达斯
附属公司

F9胚胎癌细胞中转录共调节因子和多梳组蛋白SUZ12与Hoxa1、RARbeta（2）和Cyp26A1的维甲酸反应元件的维甲酸调节相关性

罗伯特·F·吉莱斯皮等。 分子生物学杂志. .

摘要

Hox基因表达被全反式视黄酸（RA）激活，通过与靶基因的RA反应元件（RARE）结合的视黄酸受体-视黄样X受体（RAR-RXR）异二聚体结合。RAR和RXR都有三种同型（α、β和γ），它们由不同的基因编码。Hox基因也受到多梳组蛋白（PcG）的抑制，尽管这些蛋白是如何被靶向的尚不清楚。我们使用染色质免疫沉淀法研究RA治疗期间F9胚胎癌细胞（畸胎瘤干细胞）中RXRapha、RARgamma、辅因子和PcG蛋白SUZ12与Hoxa1、RARbeta2和Cyp26A1 RARE的相关性。我们证明RARgamma和RXRapha在RA治疗之前和期间与RARE相关。暴露于RA后，靶RARE的pCIP、p300和RNA聚合酶II水平升高。相反，发现SUZ12与所有研究的RARE相关，并且这些相关性通过RA治疗减弱。移除RA后，SUZ12与RARE重新关联。在目标位点同时检测到H3ac、H3K4me2和H3K27me3标记，表明存在二价结构域染色质结构。在RA介导的分化过程中，靶RARE的H3K27me3水平下降，而H3ac和H3K4me2水平保持不变。这些研究提供了对共同调节因子与RARE关联动力学的见解，并证明了RA信号与PcG阻遏之间的新联系。

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图1
图1
RT-PCR测定F9细胞RA靶基因的诱导。（A）F9细胞用RA处理指定时间，并采集RNA。采集的RNA通过半定量RT-PCR进行分析。每个实验重复至少3次；显示的数据来自一个实验。通过连续稀释24小时时间点模板证明PCR反应的线性。通过标准凝胶电泳观察产品。（B）实时PCR定量RT-PCR产物。结果显示了三个独立实验（±SE）的平均值，每个定量PCR均进行了三次。每个图形的y轴具有不同的比例。
图2
图2
RA治疗期间F9细胞中RARg和RXRa与RARE的关联。（A）ChIP分析中监测的与各自转录起始位点相关的位点图。DNA由细黑线表示。灰色方框表示DNA转录到mRNA的区域，而黑色方框表示mRNA拼接和翻译的区域。RARE的位置由向下的箭头指示，实际的RARE序列直接显示在箭头下方，用粗体字母表示结合位点。弯曲的箭头表示转录起始位点，而阴影标记表示外显子/内含子基因结构，这还没有详细说明。粗黑线表示ChIP分析期间DNA扩增的区域。示意图大致按比例绘制。（B）证明抗RARγ抗体的特异性。从Cos细胞制备全细胞提取物（WCE），这些Cos细胞要么模拟转染（m），要么转染表达RARγ（γ）、RARβ（β）或RARγ的质粒。在12%SDS-PAGE凝胶上运行每种Cos-WCE 5 mg，然后进行Western Blot分析。使用1:200稀释度的抗-RARγ蓝洗脱液检测RARγ。实验进行了3次。（C）免疫沉淀分析也证实了RARγ抗血清的特异性。模拟转染（m）或转染表达RARβ（β）或RARγ（γ）的质粒的Cos细胞被代谢标记为(35S） 蛋氨酸。从这些细胞中制备细胞提取物，并与RARγ抗血清一起用于IP（D）F9细胞经RA处理不同时间后，用DSG和甲醛固定细胞并加工成可溶性染色质。用RARγ、RXRα或IgG抗体对染色质样品进行免疫印迹，并用实时PCR定量结合DNA。折叠富集被定义为IP中特定位点的输入百分比除以同一IP中Hoxb1−18kb 3'阴性对照区的输入百分比。每个实验至少重复三次，每个样品的定量PCR分析一式三份。数据表示为免疫沉淀前输入DNA的百分比（平均值±SE）。使用Graphpad Prism 4.0进行统计分析。*符号表示统计显著差异(第页<0.05）。在统计学上存在显著差异(第页<0.05）在所有RARγIP和非特异性IgG阴性对照之间，以及在所有检测的RARE中所有RXRαIP和IgG阳性对照之间，但没有统计学意义(第页>0.05）相对于IgG阴性对照，RARγ和RXRα之间观察到的差异霍克萨1第页。
图3
图3
RA治疗期间F9细胞中pCIP和p300对RARE的招募。用RA处理F9细胞不同时间。然后用甲醛固定细胞并加工成可溶染色质。染色质样品用免疫沉淀（A）抗pCIP抗体或（B）抗p300抗体和结合DNA通过实时PCR定量。为了进行比较，用霍克斯b1−18kb 3'阴性对照基因座。每个实验至少重复三次，每个样品的定量PCR分析一式三份。数据表示为免疫沉淀前输入DNA的百分比（平均值±SE）。使用Graphpad Prism 4.0进行统计分析。统计样本(第页<0.05）不同于时间0的样本用*符号表示。
图4
图4
RA治疗期间F9细胞中RARE聚合酶II的招募。F9细胞用RA处理不同时间，然后用甲醛固定细胞并加工成可溶性染色质。染色质样品用免疫沉淀（A）识别RNA聚合酶II CTD磷酸化丝氨酸5或（B）用实时PCR定量分析非特异性兔IgG和结合DNA。为了进行比较，用霍克斯b1−18kb 3'阴性对照基因座。每个实验至少重复三次，定量PCR分析一式三份。数据表示为免疫沉淀前输入DNA的百分比（平均值±SE）。
图5
图5
RA处理不会改变F9细胞中组蛋白H3尾部在RARE处的乙酰化和二甲基化修饰。用RA处理F9细胞不同时间，然后用甲醛固定细胞并加工成可溶性染色质。染色质样品用免疫沉淀（A）抗H3K9、K14ac抗体或（B）实时PCR定量检测抗H3K4me2抗体和结合DNA。为了进行比较，用霍克斯b1−18kb 3'阴性对照基因座。从细胞培养开始，重复每个实验至少三次，并进行三次定量PCR分析。数据表示为免疫沉淀前输入DNA的百分比（平均值±SE）。
图6
图6
SUZ12在暴露于RA之前与F9细胞中的RARE相关，然后在RA治疗后解除相关。用RA处理F9细胞不同时间。然后用甲醛固定细胞并加工成可溶染色质。染色质样品用免疫沉淀（A）抗SUZ12抗体或（B）实时PCR定量检测抗H3K27me3抗体和结合DNA。为了进行比较，用骨桥蛋白VDRE阴性对照位点。的y轴第26周期（A）中的RARE图与其他位点图具有不同的尺度。从细胞培养开始，每个实验至少重复三次，并进行三次定量PCR分析。数据表示为免疫沉淀前输入DNA的百分比（平均值±SE）。
图7
图7
SUZ12与RARE快速结合，而RNA聚合酶II在去除RA后与RARE分离。（A）RA冲刷ChIP实验协议示意图。用RA处理F9细胞，然后用PBS冲洗，在甲醛交联和细胞收获之前，多次添加新鲜培养基。RA添加的时间用+RA和宽灰色条表示。PBS冲洗的时间，然后添加新鲜介质，用白色条的变化表示。阳性对照（pos）用RA处理48小时，在交联（x-link）之前未进行冲洗。阴性对照（neg）未接受RA治疗，也未在x-linking前冲洗。将“0”样本用RA处理24小时，然后立即进行x连锁并采集细胞。在24小时RA处理后，将“0漂洗”样品漂洗3次，然后立即将含有1%甲醛的培养基添加到培养皿中。添加RA和随后的步骤交错进行，以便所有样本同时进行x链接。（B）染色质样品用抗SUZ12抗体或（C）识别聚合酶II CTD磷酸化丝氨酸5并结合DNA的单克隆抗体通过实时PCR进行定量。每个基因座总输入的百分比被量化并归一化为阴性对照基因座。骨桥蛋白VDRE用作SUZ12 ChIP分析的阴性对照，Hoxb1−18kb区域用作pol II ChIP分析中的阴性对照。然后计算相对于0冲洗样品的折叠诱导率。每个实验至少重复三次，从细胞培养开始，每次实验均进行三次定量PCR分析。条形图表示折叠诱导（±SE）。使用Graphpad Prism 4.0进行统计分析。*符号表示统计显著性(第页<0.05），τ表示a第页值0.0685。除非另有说明，否则计算相对于0（冲洗）样品的统计显著性。
图8
图8
RARγ介导三个RA靶基因转录的模型。在没有RA的情况下，RARγ-RXRα异二聚体与风险调整比率β2,霍克萨1、和Cyp26A1细胞RARE可能通过与辅抑制因子的结合抑制转录。在没有RA的情况下，RA靶基因也与SUZ12相关。为了简单起见，我们描述了SUZ12覆盖整个风险调整比率β2和Cyp26A1细胞基因座，尽管这还没有实验确定。Pol II预先绑定到霍克萨1近端启动子（PP）和pol II、pCIP和p300预先绑定到风险调整比率β2罕见。配体结合后，与RARE结合的RARγ-RXRα异二聚体发生构象变化。如果RARγ-RXRα异二聚体与霍克萨1和Cyp26A1细胞R1 RARE，RA的结合导致pCIP/p300和pol II的招募。类风湿关节炎治疗也能使霍克萨13'很少与Hoxa1 PP区域相互作用。此外，Suz12在RA暴露后与三个RA靶基因分离。最后，RA需要在霍克萨州PP地区招募pol II后推动一个步骤1风险调整比率β2以便这些基因被转录。
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