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2007年9月;90(3):397-406.
doi:10.1016/j.ygeno.2007.05.004。 Epub 2007年7月12日。

剖析人BDNF基因座:双向转录、复杂剪接和多启动子

附属公司

剖析人BDNF基因座:双向转录、复杂剪接和多启动子

普鲁恩希尔德等。 基因组学 2007年9月

摘要

脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是神经营养因子中神经生长因子家族的一员,在神经系统的发育、生理和病理中发挥着重要作用。我们已经阐明了人类BDNF基因的结构,鉴定了替代转录物,并研究了它们在成人组织和大脑区域的表达。此外,测定了人类BDNF转录物的转录起始位点,并在瞬时过表达测定中分析了BDNF启动子的活性。我们的结果表明,人BDNF基因有11个外显子和9个功能启动子,它们是组织和脑区域特异性使用的。此外,显示复杂剪接和表达模式的非编码天然反义RNA从抗BDNF基因(批准的基因符号BDNFOS)转录到BDNF的基因位点。我们发现BDNF和抗BDNF转录物在活体大脑中形成dsRNA双链,这表明抗BDNF在调节人BDNF表达中起着重要作用。

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数字

补充图2
补充图2
图1
图1
人类的结构和替代转录物BDNF公司(顶部)和抗BDNF(底部)基因。利用生物信息学、RT-PCR和5′RACE分析基因组和mRNA序列数据,确定外显子和内含子的结构组织。外显子显示为框,内含子显示为线。填充框和开放框分别表示外显子的翻译区和外显子未翻译区。外显子下方和内含子上方的数字表示它们的大小。外显子和内含子大小为碱基对,除非另有说明。箭头表示转录起始位点。ATG和TAG分别标记翻译起始密码子和终止密码子的位置。垂直虚线表示各外显子的选择性剪接位点。BDNF公司外显子IX分为区域“a”、“b”、“c”和“d”,如标记外显子九位置的方框所示。BDNF公司转录本名称与主要3′外显子IXd前面使用的上游外显子有关。“A”–“L”标记抗BDNF抄本。连接转录物外显子的实线代表外显子主要的剪接模式。连接转录物外显子的虚线表示抗BDNF。外显子数字用罗马数字表示BDNF公司基因和阿拉伯数字表示抗BDNF基因。
图2
图2
(A) 人类和啮齿动物的比较BDNF公司不同研究提出的基因结构。根据Timmusk等人、Liu等人、Aid等人、Aoyama等人、Marini等人和Liu等人以及人类BDNF公司本研究确定了基因结构。外显子显示为框,内含子显示为线。在所有结构中,相同的人类外显子和与人类外显子同源的啮齿动物外显子显示为相同的颜色。本研究确定的新外显子为绿色(V)、红色(Vh)、紫色(VIII)和浅蓝色(VIIIh)。(B) 不同潜在前BDNF N末端的氨基酸序列。由外显子IX编码的氨基酸为黑色,由备选5′外显子编码的序列为蓝色。编码BDNF相应N末端的转录物列在N末端序列附近。
图3
图3
人体的半定量分析BDNF,抗BDNF,和控制间隙RT-PCR检测成人组织中mRNA的表达。左侧的罗马数字表示检测到的BDNF公司转录物和5′外显子特异性引物与位于BDNF公司外显子IXd中的编码区(补充表1)。A、 C、G和I分别指抗BDNF图1所示的成绩单。
图4
图4
人体的半定量分析BDNF,抗BDNF,和控制间隙RT-PCR检测人脑不同区域的mRNA表达。左边的罗马数字表示检测到的BDNF转录物和5′-外显子特异性引物与位于BDNF公司外显子IXd中的编码区(补充表1)。A、 C和G分别指抗BDNF图1所示的成绩单。
图5
图5
分析BDNF公司抗BDNFHEK293T和N2a细胞中的启动子活性。5′侧翼区域的相对活动BDNF公司外显子I、II、III、IV、V、Vh、VI、VII和IXabcd和抗BDNF以促进CAT表达。启动子区克隆在CAT公司基因如补充图1所示。请注意BDNF公司使用更长的反应时间可以检测到HEK239T细胞中的启动子II、V、Vh和VII。m、 模拟转染细胞,阴性对照。
图6
图6
BDNF公司抗BDNF转录物在活体人脑中形成dsRNA双链。显示了RNA双链检测测定的示意图。简言之,人类小脑总RNA经过DNA酶处理。该RNA被分成两半,其中一半用RNase A/T1处理(左侧方框),另一半用作−RNase对照(右侧方框)。两种RNA都用逆转录酶(RT)BDNF公司/抗BDNF互补区域特异性引物Dup_S1。随后,这些cDNA被用作PCR模板以检测BDNF公司/抗BDNF用引物Dup_S1和Dup_AS.ssRNA污染控制反应,用引物Dup_S2和haBDNF_S1进行双链反应。使用引物Dup_S1和Dup_AS,使用−RT反应检测基因组DNA污染。行表示RNA,双线标记互补区域BDNF公司外显子IXd和抗BDNF外显子5。底漆位置用与线条平行的箭头表示,底漆名称用斜体表示。使用寡核苷酸(dT)引物合成的人海马cDNA(PCR+对照)作为所有反应的阳性对照。

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