Regulation of the p27(Kip1) tumor suppressor by miR-221 and miR-222 promotes cancer cell proliferation

doi:10.1038/sj.emboj.7601790

.2007年8月8日；26(15):3699-708.

doi:10.1038/sj.emboj.7601790。 Epub 2007年7月12日。

miR-221和miR-222调节p27（Kip1）抑癌基因促进癌细胞增殖

卡洛斯·勒萨奇¹, 雷姆科·纳格尔, 大卫·A·伊根, 玛丽埃特·施里尔, 伊利·梅斯曼, 芒果藤, 科拉多·阿尼尔, 朱利奥·迈拉, Neri Mercatelli公司, 西尔维娅·安娜·西亚弗雷, 玛丽亚·朱利亚·法拉斯, 鲁文·阿加米

附属公司

PMID： 17627278
预防性维修识别码：项目经理1949005
内政部： 10.1038/sj.emboj.7601790

miR-221和miR-222调节p27（Kip1）抑癌基因促进癌细胞增殖

卡洛斯·勒萨奇等。欧洲工商管理硕士J. 2007.

.2007年8月8日；26(15):3699-708.

doi:10.1038/sj.emboj.7601790。 Epub 2007年7月12日。

作者

卡洛斯·勒萨奇¹, 雷姆科·纳格尔, 大卫·A·伊根, 玛丽埃特·施里尔, 伊利·梅斯曼, Annunziato Mangiola公司, 科拉多·阿尼尔, 朱利奥·迈拉, Neri Mercatelli公司, 西尔维娅·安娜·西亚弗雷, 玛丽亚·朱利亚·法拉斯, 鲁文·阿加米

附属

¹荷兰阿姆斯特丹荷兰癌症研究所肿瘤生物学部。

PMID： 17627278
预防性维修识别码：项目经理1949005
内政部： 10.1038/sj.emboj.7601790

摘要

微RNA（miRNAs）是蛋白质编码基因的有效转录后调节因子。miRNA在癌症中的错误表达模式表明miRNA在肿瘤发生中的关键功能。然而，目前的生物信息学工具并不完全支持此类miRNAs作用模式的识别和表征。在这里，我们使用了一种新的功能遗传学方法，并将miR-221和miR-222（miR-221&222）鉴定为p27（Kip1）的有效调节因子，p27是一种细胞周期抑制剂和肿瘤抑制因子。使用miRNA抑制剂，我们证明某些癌症细胞系需要miR-221和222的高活性来维持低p27（Kip1）水平和持续增殖。有趣的是，胶质母细胞瘤中miR-221和222的高水平表达与p27（Kip1）蛋白的低水平相关。因此，miR-221和222的失调表达通过抑制p27（Kip1）的表达来促进癌症生长。

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数字

图1
鉴定p27的miRNA抑制剂的基因筛查^基普1. (A类)p27Sen的示意图，这是一种在p27-3′UTR控制下稳定表达GFP的逆转录病毒载体。(B)将GFP-p27-3′UTR表达细胞的克隆群体与整个miRNA文库（miR-Lib）以单孔格式进行转导，选择并混合以进行进一步分析。进行了两个独立的实验。随后，对低表达GFP细胞进行分类，并使用miR-Array将miRNA插入物的丰度与总人口进行比较。(C)对照细胞和miR-Lib转导细胞的GFP表达谱。标记为“低GFP”的区域是从整个细胞群中筛选出来的。(D类)显示每个miRNA插入的信号和信号变化的典型MA图。(E类)前六个点击发现富含低表达GFP细胞。

图2
miR-221抑制p27的翻译^基普1. (A类)荧光素酶报告实验用*萤火虫*-萤光素酶p27-3′UTR，对照*雷尼利亚*-荧光素酶和指示的miRNA结构。荧光素酶比率*萤火虫*和*雷尼利亚*将对照样品的pH值调整为1。本文总结了三个独立的实验。(B)用miR-221和对照表达载体转导稳定的p27Sen-HeLa细胞系，并选择药物一周。一周后用流式细胞仪分析多克隆细胞群。(C)用对照或miR-221表达载体和选择的药物转导HeLa细胞一周。随后，从稳定细胞中提取总RNA，并使用miR-221和对照亲环素探针进行RPA。通道P包含未经RNase处理的探针，通道Y是酵母RNA用作对照的通道。(D类)在与B组相同的细胞群上使用p27和CDK4抗体进行免疫印迹分析。使用Tina 2.0软件进行量化。(E类)对C组中使用的相同RNA提取物进行QRT-PCR(F类)用100μg/ml环己酰胺处理稳定表达对照或miR-221载体的HeLa细胞。在指定的时间点，制备全细胞提取物，并用p27和对照微管蛋白抗体进行免疫印迹分析。使用Tina 2.0软件对谱带强度进行量化，得出的p27-微管蛋白比率绘制在回归图中。

图3
p27的特异性^基普1miRNA-221和miR-222的抑制作用。(A类)显示成熟miR-221和miR-222序列的示意图（红色，相同序列）。此外，还显示了miR-221和222的基因组位点以及miRNA载体中使用的插入物。红色方框表示miRNA前体位置。此外，p27的3′UTR^基普1如图所示。绿色方框表示两个预测的miR-221和222靶序列（如Pictar和TargetScanS软件预测的那样）。(B)荧光素酶报告实验如图2A所示。221SM和222SM是miRNAs种子序列发生改变的结构。(C)荧光素酶报告实验如图2A所示。p27-3′UTR-DM（双突变体）是一种构建物，其中预测的miR-221和222靶向序列均被修改（参见材料和方法）。（B，C）直方图显示了三个独立实验的结果摘要。

图4
用相应的antagomiRs灭活miR-221和222。(A类)显示antagomiR-221和antagomiR-222设计的示意图。(**B、 C类**)用所示荧光素酶报告体转染MCF-7细胞，如图2A所示。转染后20小时，将antigomiR-222（25μg）添加到培养基中。48小时后测定荧光素酶活性。结果显示了三个独立实验的总结。(D类)稳定对照和表达miR-221的HeLa细胞群用antagomiR-221处理24小时。制备全细胞提取物，并通过p27和对照微管蛋白抗体的免疫印迹进行分析。使用Tina 2.0软件量化色带。

图5
某些癌症细胞系对miR-221和222活性的致癌成瘾。(A类)利用所示细胞系的总RNA，使用miR-221探针进行RPA。显示了探针和成熟miR-221的尺寸。(B)所示的癌细胞系在存在或不存在antagomiR-221和anagomiR-222寡聚物的混合物中生长。治疗4天后获得图像。(C)使用3T3方案测量所示癌细胞系的生长，无论是否接触抗戈米治疗。(D类)用antagomiR-221和antagomi R-222寡核苷酸的混合物处理或不处理所示细胞系（NT，非处理）。48天后，细胞分裂，并添加诺卡唑（+Noc）。24小时后进行流式细胞术分析。(E类)细胞按B组处理，在处理3天后提取全细胞裂解液，并用抗体进行免疫印迹分析，以检测指示的蛋白质。(F类)用对照或p27-shRNA表达构建物转染U87细胞。转染效率至少为80%，由GFP处理确定（数据未显示）。24小时后，用antagomiR-221和antagomiR-222的混合物处理细胞群，并如图C所示测定增殖。p27的免疫印迹分析^基普1对野生型和p27进行微管蛋白对照^克朗-转染U87细胞。使用Tina 2.0软件量化色带。

图6
胶质母细胞瘤中失去调控的miR-221和miR-222表达与p27相关^基普1水平。(A类)对五个肿瘤冷冻组织和五个冷冻外周组织（离核心肿瘤0.5 cm）提取的RNA进行miR-221和miR-222表达的QRT-PCR。作为对照，我们使用miR-221和222-阴性的HeLa细胞，HeLa与miR-Vec-221（HeLa-221）和U87，这两种miRNAs均为阳性。括号中是三个实验的标准偏差。(B)肿瘤#4的核心和外围材料用Ki-67和p27抗体染色为棕色。细胞核被染成蓝色。(C)从肿瘤#1、2、3和5的核心（C）和外围（P）材料中获得全细胞提取物。将每个样品的20μg重量加载到凝胶上，并用p27抗体或银染色进行免疫染色，以证明负载相等。

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