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.2007年7月11日；26(13):3169-79.
doi:10.1038/sj.emboj.7601758。 Epub 2007年6月21日。

SIRT1脱乙酰酶对阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化模型中神经退行性变的保护作用

Dohoon Kim先生 1, Minh Dang Nguyen女士, 马修·多宾, 安德烈·费舍尔, 法拉赫纳兹·萨南贝内西, 约瑟夫·罗杰斯, 伊万娜·德拉勒, 约瑟夫·鲍尔, 隋光超, 肖恩·M·阿莫尔, Pere Puigserver公司, 大卫·A·辛克莱, 蔡立慧
附属公司

SIRT1脱乙酰酶对阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化模型中神经退行性变的保护作用

Dohoon Kim先生等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

随着年龄的增长，神经元的逐渐丧失是各种神经衰弱疾病的基础，包括阿尔茨海默病（AD）和肌萎缩侧索硬化症（ALS），但目前很少有有效的治疗方法。SIR2基因促进多种生物体的长寿，并可能是限制热量摄入有益健康的基础，热量摄入是一种延缓哺乳动物衰老和神经退化的饮食。在这里，我们报道了SIR2的人类同源物SIRT1在AD、ALS的小鼠模型和受到神经毒性损伤的原代神经元中上调。在AD/tau病和ALS的细胞模型中，SIRT1和白藜芦醇（SIRT1激活分子）都能促进神经元存活。在诱导型p25转基因小鼠（AD和tau病的模型）中，白藜芦醇减少了海马的神经退行性变，防止了学习障碍，并减少了已知SIRT1底物PGC-1α和p53的乙酰化。此外，在p25转基因小鼠的海马中注射SIRT1慢病毒可显著防止神经退化。因此，SIRT1在衰老和人类神经退行性疾病之间构成了独特的分子联系，并为治疗干预提供了一条有希望的途径。

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数字

图1
图1
显示进行性和严重神经退行性变的小鼠模型中SIRT1上调。(A类)p25转基因小鼠进行性神经退行性变期间（诱导2–12周后）SIRT1上调。(B类)p25转基因小鼠SIRT1水平的定量。**P（P）(T型⩽t吨)两条尾巴：0.007。(C类)p25转基因小鼠前脑中PCG-1alpha的乙酰化水平降低（诱导10-12周）。乙酰化PCG-1alpha水平的密度测定分析如下图所示。(D类)突变型SOD1G37R（品系29）中SIRT1的逐渐增加在大规模神经变性阶段（10-12个月）达到峰值。(E类)SOD1G37R小鼠SIRT1水平的量化。***P（P）(T型⩽t吨)两条尾巴：0.0004。(F类)低浓度离子霉素（1μM）和H治疗初级皮层神经元2O（运行）2（25μM）诱导与p25生成相关的SIRT1快速上调。时间以分钟表示。顶部面板显示了基于密度计的SIRT1水平分析。(克)增加剂量的离子霉素或H治疗初级皮层神经元2O（运行）2持续20分钟表明这些神经毒性刺激对SIRT1的诱导具有剂量依赖性。顶部面板显示了基于密度计的SIRT1水平分析。
图2
图2
白藜芦醇可对抗p25和突变SOD1毒性。(A类)用白藜芦醇处理48小时（50–500 nM），在GFP转染的神经元中未观察到毒性。对于所有实验（A-E），在DIV 5-7处用质粒转染大鼠原代神经元，并在转染后3 h将白藜芦醇添加到培养基中。转染后24–48小时进行神经元完整性表征。比例尺，40μm。(B类)转染p25-GFP、未经处理或经白藜芦醇（250 nM）处理24小时的死亡和健康神经元的典型共焦图像。如箭头所示，DAPI面板中的插图是转染神经元细胞核的放大图。比例尺，20μm。(C类)未经处理或用250 nM白藜芦醇处理24 h的神经元中p25-GFP诱导的细胞死亡的定量，以百分比（%）表示（54±12.2 vs.27±8%；**P（P）(T型⩽t吨)两条尾巴：0.003）。(D类)用SOD1G93A-FLAG转染、未经处理或用250 nM白藜芦醇处理48小时的神经元的典型共焦图像。右面板是左面板所示方框区域的放大图。箭头表示SOD1聚集的区域。比例尺，50μm。(E类)SOD1G93A-FLAG在未经处理或用250 nM白藜芦醇处理48 h的神经元中诱导细胞死亡的定量，以百分比（%）表示（52±3对28±3%；***P（P）(T型⩽t吨)两条尾巴：<0.001）。
图3
图3
SIRT1的过度表达可防止p25和突变SOD1毒性。(A类)过表达缺乏催化脱乙酰酶活性的SIRT1或SIRT1（H363Y）对p25 GFP毒性的影响。箭头表示转染p25-GFP的神经元，带有或不带有SIRT1（红色）。如箭头所示，DAPI面板中的插图是转染神经元细胞核的放大图。比例尺，20μm。(B类)有或无SIRT1或H363Y异位表达的p25-GFP表达神经元的细胞死亡定量。a、 对照组与p25-GFP，P（P）<0.001; b、 对照组与p25-GFP+SIRT1，P（P）<0.05; c、 对照组与p25-GFP+H363Y，P（P）<0.001; d、 p25-GFP与p25-GFP+SIRT1，P（P）<0.01; e、 p25-GFP+SIRT1与p25-GFP+H363Y，P（P）<0.01. p25-GFP与P25GFP+H363Y相比无显著性差异(P（P）>0.05). Neuman–Keuls多重比较测试的单向方差分析。(C类)SIRT1或H363Y表达后p25-GFP水平不变。h、 人；m、 鼠标。HEK和CAD细胞SIRT1表达的比较。(D类)SIRT1或H363Y过度表达对SOD1G93A毒性的影响。箭头表示用FLAG Ab检测到的SOD1聚集体。WT SOD1无毒。比例尺，25μm。(E类)SOD193A和WT SOD1-表达神经元中细胞死亡的量化，有或没有SIRT1或H363Y的异位表达。a、 对照组与G93A，P（P）<0.001; b、 对照G93A+SIRT1，P（P）<0.001; c、 对照组与G93A+H363Y，P（P）<0.001; d、 G93A与G93A+SIRT1，P（P）<0.001; e、 G93A+SIRT1与G93A+H363Y，P（P）<0.001. G93A与G93A+H363Y的对比不显著(P（P）>0.05). Neuman–Keuls多重比较测试的单向方差分析。
图4
图4
白藜芦醇可预防p25转基因小鼠的神经退化。(A类)白藜芦醇（Resv）或载体（Veh）ICV注射p25转基因小鼠的实验设计(n个=5，对于车辆（Veh）；n个=白藜芦醇（Resv）为9）。(B类)与注射载体的p25动物相比，用白藜芦醇治疗的p25动物的PGC-1α乙酰化水平降低。还显示了基于密度计的乙酰化PCG-1alpha水平分析。(C类)白藜芦醇处理的p25转基因小鼠海马中激活的caspase 3和GFAP下调，这是细胞死亡和星形胶质细胞增生的标志(n个=3），与注射载体的p25只动物相比(n个=2），如Western blots所示。未注射年龄匹配的WT小鼠(n个=2）也作为对照进行比较。与WT小鼠相比，p25转基因小鼠的SIRT1水平增加，但白藜芦醇和车用处理小鼠的SIRT水平相似。还显示了活化caspase 3、GFAP和SIRT1的密度测定值。Actin和FAK用于加载控制。(D类)白藜芦醇对p25转基因小鼠CA1区GFAP表达细胞的抑制作用(n个=3），与注射载体的p25只动物相比(n个=2）和未注入WT控制(n个=2）免疫荧光染色显示。比例尺，15μm。(E类)免疫荧光染色显示p25转基因小鼠CA1中caspase 3活性降低，p25-GFP表达细胞数量增加(n个=2）注射白藜芦醇与溶媒(n个=2). 比例尺，50μm。(F类)两周诱导的p25转基因小鼠注射ICV和白藜芦醇(n个=9）或车辆(n个=5）2–3×/周，持续3周。另一个p25转基因小鼠对照组未注射载体或白藜芦醇(n个=8). 随后，所有组和WT小鼠(n个=20）受到情境恐惧条件作用的影响。左图：在训练过程中，白藜芦醇对总活动和对电击足的逃避反应没有影响。ES，脚电击。右图：与WT同窝小鼠相比，经溶媒处理和未经处理的p25转基因小鼠在记忆测试期间表现出减少的冷冻行为(P（P）=0.0032,t吨(1,23)= 3.295;P（P）<0.0001,t吨(1,26)= 5.048). 然而，与车辆组相比(P（P）= 0.0109,t吨(1,12)=3.009）或未经处理的p25转基因小鼠(P（P）= 0.0005t吨(1,15)=4.407）白藜芦醇处理的p25转基因小鼠在记忆测试期间显示出显著改善的冷冻行为。*表示显著差异；ES，脚电击。
图5
图5
白藜芦醇逆转p25转基因小鼠中SIRT1底物p53的乙酰化。(A类)p25转基因小鼠p53表达上调(n个=4）免疫沉淀法和Western blot法检测。右侧显示了p53水平的密度分析。(B类)p25转基因小鼠中p53在赖氨酸382处的乙酰化(n个=3）免疫沉淀法检测，Western blot法检测。*表示非特定频带。(C类)在表达p25的初级海马神经元中，P53被击倒可使p25的神经毒性减轻25%。**P（P）(T型⩽t吨)两条尾巴：0.001。(D类)在转染p53的细胞系中通过RNAi高效敲除p53。(E类)p25转基因小鼠赖氨酸382处p53乙酰化减少和p53下调(n个＝3）用白藜芦醇处理。乙酰化p53水平的密度分析如底部面板所示。
图6
图6
SIRT1的表达可防止p25转基因小鼠的神经退化。(A类)与SIRT1慢病毒注射半球的CA1相比，对照病毒注射半球CA1中存在较少的p25-GFP阳性神经元。对于每只动物，计算了对照侧与SIRT1侧神经元的比率，其中SIRT1一侧等于1。计数数据见补充表1。(B、 C类)p25小鼠806的对照（左）半球和SIRT1注射（右）半球CA1海马GFP阳性神经元的典型共焦图像显示，对照半球GFP阳性细胞数量减少。比例尺，100μm。(D、 E类)对照组（左侧）和SIRT1注射组（右侧）p25小鼠807的CA1海马GFP阳性神经元的高分辨率共焦图像。与对侧对照注射侧相比，SIRT1注射p25转基因小鼠的神经完整性得到更好的保护。比例尺，15μm。(F–H（飞行高度）)GFP阳性神经元表达SIRT1，如HA抗体共同染色所示。比例尺，15μm。
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