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.2007年7月11日；26(13):3144-56.
doi:10.1038/sj.emboj.7601745。 Epub 2007年6月7日。

线粒体定位IAP拮抗剂和促凋亡丝氨酸蛋白酶果蝇Omi

马达维·查拉 1, 斯里尼瓦斯·马拉迪, 布雷特·佩洛克, 道格拉斯·德雷斯内克, Shankar Varadarajan公司, Y惠特尼·尹, 克里斯汀·怀特, 肖恩·布拉顿
附属公司

果蝇Omi，一种线粒体定位的IAP拮抗剂和促凋亡丝氨酸蛋白酶

马达维·查拉等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

尽管线粒体外膜通透性对哺乳动物至关重要，但对苍蝇来说，线粒体外膜渗透性对细胞凋亡的重要性仍存在很大争议。在此，我们证明，果蝇Omi（dOmi）是丝氨酸蛋白酶Omi/HtrA2的苍蝇同源物，是一种发育调控的线粒体膜间空间蛋白，在原位进行过程性切割，产生两种不同的凋亡抑制因子（IAP）结合基序。根据促凋亡刺激，成熟的dOmi随后被差异释放到细胞液中，在细胞液中它选择性地与果蝇IAP1（DIAP1）中的杆状病毒IAP重复序列2（BIR2）结构域结合，并取代启动子caspase DRONC。然而，这种相互作用本身不足以促进细胞凋亡，因为dOmi无法从DIAP1的BIR1结构域中取代效应器caspase DrICE。相反，dOmi通过蛋白水解降解DIAP1来减轻DIAP1对所有胱天蛋白酶的抑制，并在培养细胞和发育中的蝇眼中诱导细胞凋亡。总之，我们首次在苍蝇中证明线粒体通透性不仅发生在凋亡过程中，还导致真正的促凋亡蛋白的释放。

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数字

图1
图1
dOmi是HtrA家族成员。(A类)域名包含三个外显子，跨度约1.8 kb，包括一个286-bp 5′-UTR（灰色）、一个1270-bp编码区和一个92-bp 3′-UTR（灰色）。蛋白质序列包含一个N末端MTS、一个丝氨酸蛋白酶域、一个铰链区域和一个PDZ蛋白质相互作用域。(B)dOmi的编码序列与人类HtrA1、Omi/HtrA2、HtrA3和细菌DegS进行了比对（ClustalW）。红色条表示dOmi的两个IBM；红色方框表示HtrA家族所有成员中存在的保守活性位点丝氨酸。(C)通过将dOmi的一级氨基酸序列连接到人类Omi已解决的晶体结构上，创建了dOmi-的结构模型。dOmi具有丝氨酸蛋白酶（粉红色）和PDZ（灰色）结构域，要么单独显示（左侧结构），要么与人类Omi螺纹连接（绿色，右侧结构）。
图2
图2
dOmi是一种线粒体蛋白，在膜间隙内的两个位置输入和加工。(A类)dOmi跨线粒体外膜输入和膜间空间（IMS）处理的模型。TOM/TIM23复合物分别位于线粒体外膜和内膜上。(B)将全长Δ79或Δ92-dOmi-myc瞬时转染S2细胞24小时，并用初级抗myc或抗细胞色素染色c（c）（阳性对照）抗体，然后是二级FITC-标记的抗鼠抗体。线粒体定位是通过用Mitotracker染色细胞来确定的®红色(C)将全长野生型dOmi-myc或各种切割位点突变体转染S2细胞24小时，然后使用抗myc抗体进行免疫印迹。(D类)使用TMHMM Server v.2.0（CBS；丹麦）生成了dOmi的N末端（残基1-150）的疏水性图。内部/外部概率测定表明，残留物82–140位于膜间的同一侧，面向IMS。
图3
图3
成熟dOmi通过两个不同的IBMs结合DIAP1，并受发育调控体内. (A类)Δ79-dOmi和Δ92-dO mi中的IBM与已知的IAP拮抗剂在果蝇属（收割者、冷酷、隐藏、镰刀、Jafrac2）和人类（Δ133-hOmi，Δ55-Smac）。(B)GST-DIAP1下拉分析使用重组Δ79-dOmi和Δ92-dOmi及其相应的IBM截断（ΔAIIQ公司, ΔASKM公司)或点突变体(GGIQ、GGKM)分别是。每个dOmi蛋白也包含一个活性位点突变（S266A）。分离的蛋白质复合物通过SDS–PAGE进行分离，凝胶用考马斯蓝染色。(C)从苍蝇胚胎（12 h）裂解物中分离亚细胞组分，并与GST-DIAP1孵育。然后使用针对重组dOmi的兔多克隆抗体，清洗每个组分的DIAP1复合物并免疫印迹内源性dOmi。每个组分也进行了细胞色素免疫印迹c（c）、层粘连蛋白C、BiP和α-微管蛋白，以验证组分的纯度。(D类)对胚胎（12小时）、幼虫（二龄）、蛹和成虫的裂解液进行细胞色素免疫印迹c（c）和内源性dOmi（如面板C所述）。在每个发育阶段也分离出总RNA，并对其进行RT-PCR域名和肌动蛋白（内部控制）。
图4
图4
STS和UVB辐射在S2细胞中诱导caspase依赖性和非依赖性MOMP。在存在或不存在胰蛋白酶抑制剂Z-VAD-fmk（50μM）的情况下，将S2细胞暴露于STS（1μM）或UVB照射（在紫外线透照仪上照射5分钟）。(A类,B)随后检测细胞Δψm（JC-1染色）和DNA片段（Sub-G1峰）。此外，制备了胞浆级分，并对细胞色素进行了免疫印迹c（c）并检测效应半胱天冬酶DEVDase活性。(C,D类)同样，用全长dOmi转染细胞，暴露于STS或UVB照射下，并检测细胞色素的线粒体释放c（c）和dOmi进入胞浆，以及效应caspase DEVDase活性。(E类)S2电池（0.3×106)用对照品或域名dsRNA（40 nM）3天，暴露于STS（1μM）中4–12小时，然后检测效应半胱天冬酶DEVDase活性。为了确认RNA干扰的敲除程度，通过RT-PCR和Western blotting（inset）测定dOmi mRNA和蛋白表达水平。
图5
图5
成熟的dOmi诱导S2细胞和发育中的苍蝇眼的细胞死亡。(A类)用EGFP和野生型dOmi表达质粒共同转染S2细胞（Δ79天, Δ92天)或各种IBM变种（Δ79多米GGIQ公司, Δ92天GGKM公司)，催化失活突变体（Δ79多米S266A型Δ92天S266A型)，或PDZ截断突变体（Δ79多米Δ浦东新区, Δ92天Δ浦东新区). 通过添加CuSO，所有dOmi结构在金属硫蛋白启动子的控制下表达4在有无Z-VAD-fmk（50μM）的情况下，将（0.7 mM）添加到培养基中。通过测定GFP的百分比来评估细胞死亡+在24和48小时时，细胞仍然存在。为了进行统计分析，进行了方差分析，以及Student–Newman–Keuls临时的分析（StatView软件）：*与Vec Ctrl显著不同(P（P）<0.05); #, 与未经Z-VAD-fmk处理的细胞显著不同(P（P）<0.05). (B）Δ79-dOmi的表达导致表型变化，从一些品系的早期蛹致死到其他品系的轻度、轻微的眼睛粗糙（如图所示：GMR-gal4/+；无人机-Δ79-dOmi7B). Δ92-dOmi的表达导致持续更强的表型，从一些品系的早期蛹致死到其他品系的无眼苍蝇（如图所示：GMR-gal4/+；Δ92-dOmi5A/+). 杆状病毒半胱天冬酶抑制剂p35的共表达未能显著抑制Δ79-dOmi或Δ92-dOmi诱导的细胞死亡（如图所示：GMR-gal4/UAS-p35；Δ92-dOmi5A/+)，且催化失活dOmi突变体的表达未能诱导细胞死亡（如图所示：GMR-gal4/+；UAS-Δ79-dOmiS266A4A和GMR-gal4/+；UAS-Δ92-dOmiS266A42A). (C)转基因系与GMR-gal4杂交，并根据以下量表进行表型评分：0，无表型；1、部分存活的晚期色素细胞死亡；2、一些可行的，适度缩小眼睛大小；3、一些活的，没有眼睛或眼睛很小；4、成虫期致死；5，蛹早期致死。对9个独立品系进行Δ92-dOmi评分，对7个品系进行了Δ79-dOmi打分，每个品系至少进行了两次测试，产生了至少10只具有相同表型的苍蝇。Δ92-dOmi的表达持续导致更严重的表型(P（P）<0.02，学生的t吨-测试）。
图6
图6
成熟的dOmi不与DIAP1中的BIR1结构域结合或取代效应胱天蛋白酶DrICE。(A、 B类)GST-DIAP1和截短突变体在细菌中表达并纯化至同质性。然后使用GSH–Sepharose珠捕获蛋白质（500 nM），并用原始S2细胞裂解物（100μg）孵育（4°C下3小时），最终体积为300μl。随后分离珠复合物，用SDS-PAGE分离，并用兔抗dOmi多克隆抗体进行免疫印迹。(C,D类)将重组DrICE（175 nM）与GST-BIR1（抑制剂，3.5μM）在25°C下预培养30分钟。然后单独添加人PARP（底物，5.75μM），或与重组Δ79-dOmi、Δ92-dOmi-或IBM截断突变体（ΔAIIQ公司, ΔASKM公司)（4.5μM），并在25°C下进一步培养60分钟。Δ79-IBM肽和阳性对照物Rpr-IBM肽类（5μg）也在单独的培养中进行了测试。所有蛋白复合物用SDS-PAGE分离，凝胶用考马斯蓝染色。(E类)Δ79-IBM绑定到DIAP1-BIR1的结构模型。
图7
图7
成熟dOmi选择性地结合到DIAP1中的BIR2结构域，并取代启动子caspase DRONC。(A类,B)GST-BIR2-RING（3μM）与DRONC的N端片段（6μM）在不存在或存在Rpr-IBM肽（0-4μM）、重组Δ79dOmi、Δ92dOmi或其相应的IBM突变体（ΔAIIQ公司, ΔASKM公司)（2-16μM）。dOmi蛋白还包含一个活性位点突变（S266A），以确保dOmi's蛋白水解活性不会干扰DRONC的置换。绘制位移曲线以确定欧盟委员会50每个Rpr-IBM肽和dOmi蛋白的值。然后用SDS-PAGE分离所有蛋白复合物，并用考马斯蓝染色凝胶。(C)特定苍蝇和哺乳动物IAP拮抗剂和启动子半胱天冬酶与其各自IAP的离解常数的比较。(D类)Δ79-IBM绑定到DIAP1-BIR2的结构模型。
图8
图8
dOmi蛋白水解降解DIAP1。(A类)用pIE1-HA-DIAP1和pRmHa3-Omi（Δ79多米, Δ92天)dOmi（Δ79多米S266A型, Δ92天S266A型)或dOmi（Δ79天GGIQ公司, Δ92天GGKM公司). 在添加CuSO4（0.7 mM）诱导dOmi及其突变体表达后，免疫印迹全细胞裂解物以检测DIAP1和dOmi表达水平。(B)HA-DIAP1在S2细胞中表达，并使用抗HA抗体（262K，Cell Signaling）进行免疫沉淀。然后将免疫沉淀物与野生型Δ79-dOmi或Δ92-dOmi（50-200 nM）在37°C下孵育2 h，然后进行HA-DIAP1免疫印迹。(C)生物素化GST-DIAP1（250 ng）与重组Δ79-dOmi或Δ92-dOmi（50-200 nM）在37°C下孵育2 h，总体积为30μl，然后用链霉亲和素-HRP进行印迹。
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