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.2007年7月11日；26(13):3227-37.
doi:10.1038/sj.emboj.7601748。 Epub 2007年6月7日。

人类CIA30参与线粒体复合物I的早期组装及其基因突变导致疾病

C J R Dunning公司 1, M McKenzie先生, C苏吉安娜, M拉扎鲁, J希尔克, 康奈利, J M Fletcher（J M弗莱彻）, D M Kirby先生, D R Thorburn公司, M T Ryan先生
附属公司

人类CIA30参与线粒体复合物I的早期组装及其基因突变导致疾病

C J R Dunning公司等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

在人类中，呼吸链的复合体I由七个线粒体DNA（mtDNA）编码的亚基和38个核编码的亚基组成，它们在一个尚不明确的过程中组装在一起。到目前为止，只确定了两个复杂的I装配因子，并且还不清楚每个因子是如何起作用的。在这里，我们表明，人类复合物I组装因子CIA30（复合物I中间相关蛋白）在组装的早期阶段与新翻译的mtDNA编码的复合物I亚单位相关联，然后在后期解离。使用抗体，我们鉴定了一名CIA30缺陷患者，该患者患有心脑肌病，复合物I的水平和活性降低。遗传分析显示，该患者编码CIA30的NDUFAF1基因的两个等位基因都有突变。患者细胞中的复合体I组装在早期阶段存在缺陷，亚基被降解。使用新型慢病毒系统用正常CIA30补充患者成纤维细胞的缺陷，恢复了稳态复合物I水平。我们的结果表明，CIA30是复合物I早期组装的关键成分，其基因突变可导致线粒体疾病。

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数字

图1
图1
CIA30的特性。(A类) [35S] -标记的CIA30（pCIA30）和OTC（pOTC）前体形式与从HEK-293T中分离的线粒体在37°C下孵育，孵育时间点显示是否存在膜电位（Δψ米). 在SDS-PAGE和磷光图像分析之前，分别用蛋白酶K（50μg/ml）和不用蛋白酶K处理样品。(B类)分离的线粒体受到超声波或碱性（碳酸盐、钠2一氧化碳三)提取。处理后，使用CIA30、mtHsp70和Tom40抗体对可溶性（S）和不溶性（P）组分进行SDS-PAGE和Western blot分析。(C类)在用针对CIA30或复合物I（CI）或III（CIII）亚单位的抗体进行BN-PAGE和Western印迹之前，将从原代成纤维细胞分离的线粒体（60μg蛋白质）溶解在1%（w/v）洋地黄素、1%（w/v）DDM或1%（w/5）Triton X-100（TX-100）中。指出了超复合物或全酶的相对位置。
图2
图2
与CIA30共免疫沉淀复合物I亚单位。将HEK-293T细胞的线粒体溶解在1%（w/v）Triton X-100中，然后用针对CIA30的抗体或免疫前血清与蛋白-A Sepharose偶联进行免疫沉淀。然后将洗脱部分和未结合部分的样品（总量的2%）应用于Tris–Tricine SDS–PAGE，然后进行Western转移和抗体免疫修饰。
图3
图3
mtDNA编码的复合物I（CI）亚单位在组装的早期阶段与CIA30相关。(A类)含有放射性标记mtDNA-编码亚单位（0小时追踪）的线粒体的BN-PAGE分析，用αCIA30抗体免疫缺失（通道2、4和6）。免疫前血清也用于对照消耗（1、3和5道）。通过放射自显影术检测到含有放射性标记的mtDNA编码亚单位的蛋白质复合物（通道1和通道2）。在此之后，使用抗CIA30抗体（第3和第4道）以及抗CI和复合物II抗体（第5和第6道）对车道进行Western blot分析。(B类)放射标记后，细胞被追踪不同时间，如图所示。分离线粒体，将其溶解在Triton X-100中，并与与CIA30抗体或免疫前血清偶联的蛋白A-Sepharose孵育。结合蛋白通过SDS–PAGE和荧光成像进行分析（泳道2–7）。标记的亚单位分布图（对照）显示在第1栏中，代表每种联合免疫沉淀中所用材料的16.5%。显示了mtDNA编码的亚单位。
图4
图4
鉴定CIA30降低的复杂I缺陷患者细胞系。(A类)从患有复杂I缺陷的对照组（C）和患者（P1–P5）的成纤维细胞中分离的线粒体应用SDS–PAGE、Western blotted，并用CIA30、Tom40和mtHsp70抗体进行检测（左表）。患者的成纤维细胞复合体I活性在未知遗传原因（P2）或复合体I亚基基因有两种致病性突变的对照组的10%至50%之间NDUFV1型（第3页），NDUFS4型（第4页）或NDUFS6系列（第5页）。根据Tom40定量患者1（P1）的稳态CIA30水平。数据为平均值±标准误差。，n个=3（右侧面板）。(B类)通过BN-PAGE和免疫印迹法，使用抗复合物I（CI）和复合物II（CII；左图）抗体分析患者1（P1）成纤维细胞中复合物I的稳定水平。SC=复合物I/复合物III2超复杂。根据络合物II量化络合物I的稳态水平。数据为平均值±标准误差。，n个=3（右侧面板）。(C类)对照组（C）和患者1（P1）成纤维细胞的线粒体提取物对复合物I亚基和复合物II 70kDa亚基（作为对照）进行SDS-PAGE和Western blot分析。(D类)测量患者1（P1）淋巴母细胞中的呼吸链酶活性，并对照线粒体标记酶柠檬酸合成酶进行标准化，并显示为对照平均值的百分比。垂直线表示6个对照淋巴母细胞系的观察范围。
图5
图5
患者1细胞中的复合物I组装受损。(A类)在对mtDNA编码的亚单位进行放射标记后，对照组或患者1的成纤维细胞被追踪不同时间，如图所示。分离线粒体，在Triton X-100中溶解，然后进行BN-PAGE，然后进行磷光图像分析。CI、CIII2、CIV和CV。星号(*)表示~830 kDa的中间复合体。(B类)在不同追踪时间对对照组（左组）和患者1（右组）成纤维细胞的放射性标记mtDNA编码亚单位进行2D-PAGE分析。分离线粒体，在Triton X-100中溶解，在第一维进行BN-PAGE，然后在第二维进行SDS-PAGE和磷光成像仪分析。图中显示了～460和～830 kDa组装中间体和呼吸链复合体的位置。指示了ND1和ND2的位置。CI=复合物I，CV=复合物V，CIII2=复合物III二聚体，CIV=复合物IV，CIV我=复杂CIV中间体，SC=CI/CII2超复杂。
图6
图6
基因筛查NDUFAF1号机组患者1。(A类)相关的色谱痕迹NDUFAF1号机组来自对照组、患者1和患者父母的序列。该患者为c.1001A>c和c.1140A>G突变的复合杂合子，患者母亲为c.1001A>c突变的杂合子而患者父亲为c.1140A>G突变杂合子。(B类)CIA30突变区的氨基酸序列比对智人（人类，登录号#Q9Y375），牛头怪（牛，加入号XP_615202），小家鼠（鼠标，登录号NP_081451），热带非洲爪蟾（氙，登录号NP_001017153.1），黑腹果蝇（登录号：NP_6517181.1），秀丽隐杆线虫（登录号NP_506361.1）和N.克拉萨（登录号：O42636）。阴影表示四个或更多物种中的相同残留物。(C类)已预测NDUFAF1号机组基因结构显示了外显子3（顶部）内突变的位置以及对照组和患者1外显子三（底部）内预测的供体剪接位点。显示了剪接位点概率的预测百分比分数。SpliceSiteFinder预测，c.1140A>G突变将患者1的首选供体剪接位点向上游移动6 bp，导致6 bp编码序列缺失。(D类)使用位于NDUFAF1号机组来自对照组和患者1成纤维细胞的cDNA外显子2和4，在无环己酰亚胺（CHX）的情况下生长。患者cDNA除了预期的333 bp片段外，还显示了第二个较小的片段，这与SpliceSiteFinder预测的剪接缺陷一致。(E类)通过克隆NDUFAF1号机组患者1 cDNA中跨越外显子2-4的cDNA片段。在21个测序克隆中，5个cDNA序列代表携带c.1001A>c（Thr-Pro）突变的预期母体等位基因。在16个父系衍生cDNA序列（包含c.1001A）中，4个包含c.1140A>G（Lys to Arg）突变，而12个缺少外显子3编码的最后6 bp（Val和Lys缺失），这与预测的剪接缺陷一致。
图7
图7
患者细胞系中野生型CIA30的表达增加了复合物I水平。将患者1成纤维细胞（泳道2-4）和使用慢病毒（LV）载体用野生型CIA30转染的成纤维细胞（泳道5-7）与4HT孵育指定时间。图中还显示了未转染的控制细胞（通道1）。(A类)分离线粒体并使用抗CIA30抗体进行SDS-PAGE和Western blotting。(B类)将与A中相同的样品溶解在Triton X-100中，并使用抗复合物I和复合物II亚单位的抗体进行BN-PAGE和免疫印迹分析。SC=复合物I/复合物III2超复杂。
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