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.2007年8月；81(16):8613-20.
doi:10.1128/JVI.00606-07。 Epub 2007年6月6日。

两个不同的低pH步骤促进痘苗病毒的进入

艾伦·C·汤斯利 1, 伯纳德·莫斯
附属公司

两个不同的低pH步骤促进痘苗病毒的进入

艾伦·C·汤斯利等。 J维罗尔. 2007年8月.

摘要

痘苗病毒通过胞内途径和质膜进入细胞。内胚体途径的证据基于以下发现：在pH值<6的条件下处理附着在质膜上的成熟病毒可以增强进入，而内胚体酸化抑制剂可以减少进入。许多使用内体途径的病毒的特点是在膜附着之前通过低H处理病毒来灭活其感染性。然而，我们在这里表明，将未附着的痘苗病毒病毒暴露在37℃的低pH值下并不会改变其传染性。相反，这种处理稳定地激活了病毒，如报告基因表达所测，病毒在随后加入细胞后加速进入所示。此外，在吸附到质膜后进行第二次低氢处理并没有进一步提高进入速率。然而，吸附前激活的病毒粒子的进入对胞内酸化抑制剂仍然敏感，而吸附后用低pH值处理的病毒粒子具有耐药性。蛋白酶消化法很好地模拟了低pH值对病毒离子的激活，表明这两种处理方法的作用机制是相关的。尽管病毒粒子表面蛋白D8和A27的蛋白酶切割与活化相关，但通过单独删除这些基因构建的突变病毒没有表现出活化的表型。我们提出了一种牛痘病毒通过内体进入的两步模型，在该模型中，通过低pH值或蛋白酶激活或揭开融合复合体是限速的，但不会消除第二个低H步骤介导的膜融合。

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图1。
图1。
在没有靶膜的情况下进行短暂的低氢处理对MV感染性和合胞体形成的影响。（A） 将纯化的VACV WR MV在37°C的pH5或pH7.4缓冲液中暴露3分钟，并通过菌斑试验测定感染性滴度。（B） 纯化的VACV WR MV在37°C（预吸附）下暴露于pH 5或pH 7.4缓冲液中3 min，并在4°C下吸附于BS-C-1单层膜上1 h。然后将细胞浸入37°C的pH 5或pH 7.4缓冲液中（吸附后）。3分钟后，用含环己酰亚胺的EMEM替换缓冲液，并在37°C下培养3小时。细胞固定后，分别用Alexa Fluor 568-指骨肽和DAPI染色，以显示肌动蛋白丝和DNA。
图2。
图2。
在没有靶膜的情况下，通过低H处理激活MV。（A） BS-C-1细胞在37°C下用araC处理1 h，然后用WRvFire MV孵育，该MV在37°CpH5或pH7.4缓冲液中孵育3 min。在4°C下1小时后，通过洗涤去除未吸附的病毒，并在37°C下培养细胞。在温度升高后的指定时间，对细胞进行裂解，并测定Luc活性。Luc活性表示为相对光单位（RLU）。实验重复进行，数据点代表平均值±标准误差。（B） n个-倍数增强表示用来自面板A的pH 5处理的MV感染的细胞的Luc活性与pH 7.4处理的MV感染的细胞的Luc活性的比率。（C）纯化的WRvFire MV在pH 5或pH 7.4缓冲液中孵育，如面板A所示，然后在37°C的pH 7.4下孵育长达30分钟。在横轴上指示的时间之后，将病毒悬浮液吸附到细胞上，然后在37°C下孵育1小时，随后如图A图例所述测定Luc活性。（D）将纯化的WRvFire MV在37°C下暴露于pH 5或pH 7.4缓冲液中3分钟，并如图A图例所述吸附到细胞上。然后清洗细胞，并在37°C下用pH 5或pH 7.4缓冲液培养3分钟。在此步骤之后，将细胞在37°C下培养1 h，进行裂解，然后按照面板A所述对Luc活性进行分析。（E）将纯化的WRvFire MV在4°C或37°C的pH 5或pH 7.4缓冲液中暴露3 min，然后用4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸在过量的EMEM中中和至4°C。在4°C下将病毒吸附到BS-C-1单层上1 h。之后，在37°C下用pH 5或pH 7.4缓冲液清洗细胞单层并处理3 min。然后将细胞在37°C下孵育1 h，进行裂解，并检测Luc活性。
图3。
图3。
在没有靶膜的情况下，由低pH激活的MV仍然通过低pH依赖性途径进入细胞。（A和B）纯化的WRvFire MV在37°C下暴露于pH 5（pH 5 PRE）或pH 7.4缓冲液（pH 7.4 PRE）中3分钟，中和并覆盖在BS-C-1单层膜上，该单层膜已用指示量的巴非霉素A1或莫能菌素进行37°C预处理1小时。在清洗细胞单层之前，允许病毒在4°C下继续吸附1小时，并在适当的抑制剂存在下在37°C下再培养1小时。然后对细胞进行裂解和Luc活性分析。作为对照，未经处理的WRvFire MV被吸附到用巴非霉素A1或莫能菌素预处理过的BS-C-1单层中，并在pH5缓冲液（pH5 POST）培养3分钟后诱导其在质膜上融合，或通过pH7.4缓冲液（pH 7.4 POST）模拟处理，允许其通过低H内吞途径进入。实验重复进行，数据点代表平均值±标准误差。RLU，相对灯光单位。（C和D）纯化的WRvFire MV在37°C下用pH 5（pH 5 PRE）或pH 7.4缓冲液（pH 7.4 PRE）处理3分钟，并覆盖在37°C下用巴非霉素A1预处理1小时的BS-C-1单层上。在清洗细胞并在37°C下用pH 5（pH 5 POST）或pH 7.4（pH 7.4 POST）缓冲液培养3分钟之前，允许病毒在4°C下持续吸附1小时。然后在37°C下将细胞在巴非霉素A1的存在下再培养1 h，进行裂解，并检测Luc活性。
图4。
图4。
通过木瓜蛋白酶消化激活MV。（A） 将纯化的WRvFire MV与指定量的木瓜蛋白酶或模拟物在37°C下孵育30分钟，然后稀释至含有2.5%FBS的冷EMEM中进行猝灭。然后将MV添加到BS-C-1单层中，并允许病毒在4°C下继续吸附1小时。通过洗涤去除未吸附的病毒，将细胞在37°C下培养1 h，裂解，然后分析Luc活性。（B） 在接种WRvFire MV之前，用araC在37°C下处理BS-C-1细胞单层1小时，该MV用50μg/ml木瓜蛋白酶消化或在37°C下模拟处理30分钟。通过清洗去除未吸附的病毒，并在37°C下培养细胞。在指定的时间，细胞被裂解，Luc活性被测量为相对光单位（RLU）。实验重复进行，数据点代表平均值±标准误差。（C） n个-折叠增强表示感染木瓜蛋白酶处理的细胞与模拟处理的B组MV细胞的Luc活性之比。
图5。
图5：。
木瓜蛋白酶消化激活的MV通过低氢依赖途径进入细胞。将纯化的WRvFire MV与50μg/ml木瓜蛋白酶在37°C下培养30分钟（papain），或模拟处理（mock papain。RLU，相对灯光单位。病毒吸附在4°C下持续1小时，然后清洗细胞单层，并在抑制剂存在下在37°C下再培养1小时。然后对细胞进行裂解和Luc活性分析。作为对照，未经处理的WRvFire MV被吸附到用巴非霉素A1或莫能菌素预处理的BS-C-1单层上，并通过用pH 5缓冲液短暂孵育（pH 5 POST）诱导在质膜融合，或通过用pH 7.4缓冲液模拟处理（pH 7.4 POST）允许通过低pH内吞途径进入。
图6。
图6。
只有在吸附后低氢处理后，激活的MV才能诱导细胞间融合。纯化的WR MV在37°C下用pH 5或pH 7.4缓冲液吸附（预吸附）前处理3分钟，或用50μg/ml木瓜蛋白酶消化30分钟，然后在4°C下以300 PFU的倍数吸附到BS-C-1细胞上1小时。然后将细胞浸入37°C的pH 5或pH 7.4缓冲液中（吸附后）。3分钟后，用每毫升含300μg环己酰亚胺的EMEM替换缓冲液，并在37°C下培养3小时。细胞固定后，分别用Alexa Fluor 568-指骨肽和DAPI染色，以显示肌动蛋白丝和DNA。
图7。
图7。
木瓜蛋白酶对MV表面蛋白的消化以及缺失对活化的影响。（A） 将纯化的WRvFire MV与指定浓度的木瓜蛋白酶在37°C下培养30分钟。在此之后，添加40 mM使木瓜蛋白酶失活N个-乙基马来酰亚胺，离心收集颗粒。这些蛋白通过SDS-PAGE进行解析，转移到硝化纤维素膜上，并用针对MV膜相关蛋白A21、L5、A27、H3、D8和L1的兔多克隆抗体进行Western blotting。右侧显示了标记蛋白的质量，单位为千道尔顿。（B） 通过同源重组构建WRvFire重组病毒，删除A27L（△A27vFire）基因或D8L（△D8vFire。将ΔA27vFire、ΔD8vFire和WRvFire的纯化MV在4°C下吸附到BS-C-1单层上1小时。在此之后，洗涤细胞单层，并在37°C下暴露于pH 5或pH 7.4缓冲液中3分钟。然后将细胞在37°C下孵育1小时，裂解，然后测定Luc活性。这个n个-折叠增强表示pH5和7.4处理的Luc活性比率。
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