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2007年8月30日;164(2):207-17.
doi:10.1016/j.jneumeth.2007.04.013。 Epub 2007年5月4日。

免疫组织化学图像分析和流式细胞术定量分析大鼠脊髓小胶质细胞对周围神经损伤的反应

附属公司

免疫组织化学图像分析和流式细胞术定量分析大鼠脊髓小胶质细胞对周围神经损伤的反应

J黑胡子等。 神经科学方法杂志

摘要

微胶质增生症与几种神经疾病的病理生理学有关,包括神经性疼痛。因此,微胶质增生的扰动是神经病理性疼痛的机制和药物开发目标,这突出了对微胶质增生测量的特定、敏感和可重复方法的要求。在本研究中,我们使用与L5脊神经横断相关的脊髓微胶质增生症及其米诺环素诱导的衰减来:(1)评估新的基于软件的半定量图像分析范式,以评估免疫组织化学图像。OX42免疫反应显示微胶质增生。对几种图像分析范式进行了评估,并与先前验证的主观分类评分量表进行了比较。这种比较表明,对OX42免疫反应细胞占据的脊髓定义区域的比例的灰度测量是一种稳健的图像分析范式。(2) 开发并验证用于量化脊髓微胶质增生症的流式细胞术方法。流式细胞术可靠地定量了脊髓细胞悬液中的小胶质细胞增生,使用OX42和ED9免疫反应鉴定小胶质细胞。结果表明,小胶质细胞增生的免疫组织化学揭示的图像分析可靠地检测了脊髓小胶质细胞增生对周围神经损伤的反应及其药理学衰减。此外,流式细胞术为定量分析神经损伤引起的脊髓微胶质增生症提供了另一种方法。

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数字

图1
图1
(A–D)OX42-IR显示的L5脊髓背角切片(15μm)中微胶质增生程度的代表性图像。(A)得分=“0”,幼稚脊髓组织中观察到的静息小胶质细胞形态;(B) score='1',L5 SNT假手术动物典型的轻微小胶质细胞激活;(C) score='2',预先用米诺环素治疗L5 SNT大鼠的中等微胶质增生特征;(D) 得分=“3”,L5 SNT大鼠术后第7天观察到广泛的微胶质增生(比例尺30μm)。
图2
图2
脊髓小胶质细胞的流式细胞术鉴定。在所示的代表性实验中,对术后第7天幼年或L5 SNT神经损伤大鼠的同侧和对侧脊髓组织进行流式细胞术分析(见第2节)。(A) 如密度图所示,小胶质细胞被鉴定为OX42(CD11b/c)和ED9(CD172a)阳性事件。然后根据门控OX42/ED9阳性事件的数量对每毫克组织中的小胶质细胞进行量化(见第2节)。图中包含的百分比值表示被鉴定为小胶质细胞的收集细胞的总百分比。(B) 幼年和受伤动物OX42门控同侧脊髓细胞上ED9(黑线)与同种匹配对照抗体(灰色填充)的代表性荧光强度直方图。
图3
图3
定量分析术后第7天用米诺环素(40 mg/kg)治疗的幼年、假手术、神经损伤(L5 SNT)和L5 SNT-神经损伤动物的L5腰椎组织同侧和对侧微胶质增生症。(A) 根据OX42-IR水平和小胶质细胞形态,免疫组织化学采用4点评分法对微胶质细胞增生症进行定性评级,评分范围为0(无微胶质细胞增多症)至3(明显的微胶质细胞减少症)。结果表示为平均评分±S。8–11个脊髓切片的电镜检查。(B) L5腰椎脊髓组织中每mg组织中总OX42/ED9阳性细胞的定量流式细胞术分析。结果表示为平均值±S。E.M.公司(n个=4/组)。幼稚组和治疗组同侧脊髓的差异*第页 > 0.05, **第页 > 0.01. 每个实验组内同侧和对侧脊髓组织的差异,第页 > 0.05.
图4
图4
在术后第3、7、9和14天,对L5腰椎脊髓组织中每mg组织的总OX42/ED9阳性事件(A)和OX42阳性事件(B)的ED9平均荧光强度(MFI)进行流式细胞术时间进程分析,并与L5 SNT手术动物进行比较。结果以平均值±S表示。E.M.公司(n个=4/组)。幼稚组和治疗组同侧脊髓的差异*第页 > 0.05, **第页 > 0.01. 每个实验组内同侧和对侧脊髓组织的差异,第页 > 0.05.

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