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.2007年9月15日；110(6):1970-81.
doi:10.1182/bloud-2006-09-044776。 Epub 2007年6月4日。

HMGB1在TLR9介导的CpG-DNA炎症反应中的新作用

斯坦尼米尔·伊万诺夫 1, 阿纳·马里亚·德拉戈伊, 王欣（Xin Wang）, 科拉多·达拉科斯塔, 詹妮弗·劳滕, 乔瓦娜·马斯科, 乔瓦尼·西蒂亚, 乔治·S·雅普, 银生丸, 克里斯汀·比隆, 马可·比安奇, 王海超（Haichao Wang）, 文明珠
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HMGB1在TLR9介导的CpG-DNA炎症反应中的新作用

斯坦尼米尔·伊万诺夫等。 血液. .

摘要

CpG-DNA或其合成类似物CpG-ODN通过Toll样受体9（TLR9）激活先天免疫。然而，CpG-DNA激活TLR9的机制尚不清楚。在这里，我们将HMGB1鉴定为CpG-ODN结合蛋白。HMGB1在内质网-高尔基体中间室（ERGIC）中与TLR9相互作用和预结合，并在CpG-ODN的作用下加速TLR9向早期内体的再分配。CpG-ODN刺激巨噬细胞和树突状细胞分泌HMGB1；反过来，细胞外HMGB1加速CpG-ODN向其受体的传递，导致TLR9依赖性的IL-6、IL-12和TNFalpha分泌增加。HMGB1缺失导致IL-6、IL-12、TNFalpha和iNOS对CpG-ODN的反应缺陷。然而，细胞内TLR9-相关HMGB1的缺乏可以通过细胞外HMGB1进行补偿。因此，DNA结合蛋白HMGB1穿梭于免疫细胞内外，并调节对CpG-DNA的炎症反应。

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数字

图1
图1
DNA-结合蛋白HMGB1是巨噬细胞在应答IFNγ时释放的CpG-DNA结合因子（A）纯化HMGB1作为CpG-DNA结合蛋白。原始264.7电池（2.5×106/mL）用IFNγ（30 ng/mL）处理18小时。将无细胞上清液（50 mL）缓慢加载（10 mL/h）到单链DNA-纤维素柱上，用缓冲液a（20 mM Tris-Cl，pH 8.8，50 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM-DTT，5%甘油）预平衡。吸收后，用150 mL缓冲液A依次清洗色谱柱，并用缓冲液A中150 mL 0.1 M NaCl冲洗。用缓冲液B（5 mM KH2人事军官4/NaOH，pH 7.9，10%甘油）。在每个组分中，将30μL加载到10%SDS-PAGE上，然后进行银染。将蛋白质含量最高的组分2、3和4混合，用缓冲液A在0.16 M NaCl下稀释，用0.1 mg生物素-1018 ODN培养30分钟，然后用0.5 mL链霉亲和素琼脂糖珠在4°C培养过夜。用含0.16 M NaCl的缓冲液A洗涤珠子，煮沸，并加载到10%SDS-PAGE上，通过银染色检测蛋白质。切除所有可见带并进行质谱分析。列出了几种具有代表性的HMGB1肽。（B） HMGB1优先结合CpG-ODN（1018、1668和D-19）而非对照（1019、n-1668和c-405）。在不存在（对照）或存在CpG-ODN-生物素（5μg）的情况下培养小鼠rHMGB1（25 ng）或组蛋白H2A（25 g）60分钟。ODN用链霉亲和素琼脂糖珠免疫沉淀，洗涤，并用抗HMGB1抗体进行免疫印迹分析（IB）。通过从每个沉淀反应中收集5%的上清液来估算未结合HMGB1或H2A的水平。列出了各个蛋白质带的像素强度的灰度值（范围为1到250）。结果分别代表HMGB1和H2A结合的6个或3个可重复独立实验中的1个。（C） 寡聚物1018和1019在HMGB1含量增加的情况下的CD光谱。所有光谱都是在20°C、20 mM磷酸盐缓冲液、pH 7.0、10 mM NaCl、初始DNA浓度为10μM的条件下获得的。从红色到紫色的痕迹对应于向寡聚物溶液中添加0、1、2、2.8、4.5或10μM蛋白质所获得的光谱。通过减去缓冲液和蛋白质，并补偿稀释，对光谱进行校正。面板“HMGB1单独”显示了0、1、2、2.8、4.5或10μM蛋白质（在同一缓冲液中且不存在DNA）的记录光谱，以表明在此处考虑的波长范围内，对记录光谱进行的校正是中性的。
图2
图2
HMGB1增强细胞因子对CpG-ODNs的反应（A）CpG-ODN触发HMGB1的发布。BMDC（3×106细胞/mL）和BMDM（2×106用CpG-ODN（10μg/mL）处理指定时间段。对浸泡细胞的培养基（40μL）进行SDS-PAGE，并用抗HMGB1或抗LDH抗体进行免疫印迹（IB）。作为阳性对照，使用2μg巨噬细胞全细胞裂解物。通过台盼蓝排除法测定细胞活力。（B-D）细胞外HMGB1以TLR9依赖方式增强CpG-DNA对细胞因子的诱导。细胞接种于1至2.5×105/然后用CpG-ODN、PGN或LPS处理，或不处理。除LPS外，所有治疗均使用LPS抑制剂多粘菌素B（10μg/mL）。（B） 在有或无rHMGB1（50 ng/mL）的情况下，用CpG-ODN（10μg/mL）、LPS（0.2或1μg/mL。用ELISA法检测IL-6分泌（三倍平均值±SD）。实验重复了3次。（C） 在有或无rHMGB1（1μg/mL）的情况下，用CpG-ODN（10 nM至1000 nM）处理BMDC，或不处理24小时。采用ELISA法评估IL-6、IL-12和TNFα分泌水平（三倍平均值±SD）。实验重复了3次。（D，上面板）来自野生型（wt）的BMDM，第9天−/−，或Myd88（Myd88）−/−小鼠接受LPS（0.2μg/mL）、CpG-ODN（10μg/mL；ELISA检测IL-6分泌。条形图表示一式三份的6个独立实验的平均值加上或减去SD(**P（P）<.001，学生t吨测试）。（D，下部面板）来自重量的BMDC，4米塔尔，或Tlr2号机组−/−用LPS（0.1μg/mL）、PGN（10μg/mL。ELISA检测IL-6分泌。（E） rHMGB1不影响BMDC对CpG-ODN的摄取。如图所示，在有或无rHMGB1（250 ng/mL）的情况下，用CpG-ODN-Cy5处理细胞1小时。用胰酶消化细胞，荧光激活细胞分选（FACS）分析Cy5阳性细胞。（F） TLR9从用CpG ODN（10μg/mL）处理的WEHI-231细胞的裂解物中免疫沉淀。PCR检测TLR9免疫沉淀物（IP）中是否存在CpG-ODN。通过免疫印迹法（IB）评估每个反应的免疫沉淀TLR9水平。（G） rHMGB1加速了CpG-ODN/TLR9复合物的形成。WEHI-231细胞单独用CpG-ODN（10μg/mL）处理或用rHMGB1（50 ng）预培养1小时。TLR9被免疫沉淀，TLR9复合物中CpG-ODN的水平通过PCR进行评估。
图3
图3
BMDM含有富含HMGB1和TLR9的囊泡，参与CpG-ODN识别（A）在CpG-ODN治疗之前，HMGB1与TLR9相关。使用TLR9缺陷和wt脾细胞的裂解液来识别TLR9带（左侧面板）。用CpG-ODN（10μg/mL）、GpG-ODR（10μg/mL）或肽聚糖（PGN，10μg/mL）处理WEHI-231细胞，处理时间为指定时间。HMGB1是从细胞裂解物中免疫沉淀出来的，用IB检测沉淀物中是否存在TLR9或HMGB1（左面板）。Wt和TLR9缺陷的脾细胞用CpG ODN（10μg/mL）处理指定的时间点或不处理（右上图）。TLR9被免疫沉淀，HMGB1与TLR9的共沉淀被IB测定。来自wt、HMGB1缺陷细胞和TLR9缺陷细胞的全细胞裂解物被抗HMGB1和抗TLR9抗体探测（右下方）。（B） 静态BMDM的共焦显微镜显示HMGB1和TLR9在囊泡结构中共定位（在z堆叠图像中由三角形表示），始终靠近细胞核。两个囊泡的深度切片如i-iv所示。用抗HMGB1/FITC和抗TLR9/罗丹明检测蛋白质。（C） 如图所示，用CpG-ODN-Cy5（1018，5μg/mL）处理的BMDM固定、渗透，并用抗TLR9/罗丹明和抗HMGB1/FITC染色。△ 表示含有HMGB1/TLR9的小泡；▴ 表明含有CpG-DNA的小泡。实心箭头指向管状溶酶体室中分散的CpG-ODN-Cy5染色。（D） 含有至少一个TLR9/HMGB1囊泡的BMDM百分比的量化。在至少3个独立实验中，用CpG-ODN（1018，5μg/mL）处理或不处理细胞。对单个平面内清晰可见的水泡进行计数。
图4
图4
含有HMGB1/TLR9的小泡与calnexin、GM130和ERGIC-53共定位，但缺乏溶酶体标记（A）含有TLR9的小泡聚集了嗜酸荧光团溶菌酶跟踪器。BMDM在用CpG-ODN（5μg/mL）刺激前用LysoTracker处理30分钟，然后固定、渗透并用抗TLR9/FITC染色。开口三角形表示具有代表性的囊泡。（B） 在用CpG-ODNs（5μg/mL）刺激后，用抗HMGB1/FITC和抗LAMP-1/罗丹明对BMDM进行染色。△ 表示含有HMGB1的囊泡；▴, 含CpG-DNA的囊泡；和↑, 管状溶酶体室。（C-D）在用CpG-ODN-Cy5（5μg/mL）刺激10分钟之前或之后，用抗GM130/Alexa488（C）或抗calnexin/Alexa48（D）和抗TLR9/Alexa568或抗HMGB1/Alexa568BMDM染色。通过间接免疫荧光获得共聚焦图像。实心箭头表示GM130/钙内毒素与TLR9或GM130与HMGB1之间的共定位。实心三角形表示含有CpG-ODN-Cy5以及GM130和TLR9或HMGB1的囊泡。开口三角形表示囊泡含有HMGB1/TLR9和CpG-ODN，但缺乏calnexin或GM130。（E） 用抗家鼠Alexa568/anti-rabbit-Alexa568和antioat-Alexa488对BMDM进行对照染色。（F） 仅含CpG-ODN的囊泡百分比，在TLR9/HMGB1存在下的CpG-ODN，或在TLR9/HMGB1和GM130或calnexin存在下的CDG-ODN。从两个独立的实验中分析囊泡。（G，H）用抗ERGIC-53/Alexa488和抗TLR9/Alexa568或抗HMGB1/Alexa568对静止（G）或经处理（H）的BMDM进行染色。显示ERGIC-53/TLR9和ERGIC/HMGB1（实心箭头）之间具有代表性的共定位的矩形区域被放大。在ERGIC-53存在或不存在的情况下，CpG-ODN与TLR9/HMGB1的颜色化分别用实心或开放三角形表示。
图5
图5
囊泡中的HMGB1来自细胞核（A）LMB抑制HMGB1易位到含有TLR9的囊泡中。在有或无20 ng/mL LMB的情况下培养BMDM 45分钟，然后用CpG-ODN-Cy5（1018，5μg/mL）处理。△ 表示含有HMGB1的囊泡；▴, 含CpG-DNA的囊泡；和↑, 含CpG-DNA的早期囊泡，在被HMGB1/TLR9的囊泡获取之前。（B） 定量分析经或不经20 ng/mL LMB处理45分钟的BMDM囊泡内HMGB1和TLR9在背景荧光上的荧光（平均值±SEM，n=35**P（P）<.001，学生t吨测试）。（C） LMB损害TLR9-HMGB1复合物的形成。在用CpG-ODN（10μg/mL）刺激30分钟之前，用20 ng/mL LMB处理45分钟的WEHI-231细胞裂解液免疫沉淀HMGB1。（D） 外源性添加rHMGB1可以恢复小泡中HMGB1的存在。rHMGB1（25 ng/mL）与CpG-ODN-Cy5（1018，5μg/mL）孵育60分钟，并添加到用20 ng/mL LMB处理的BMDM中45分钟。▴ 表明TLR9与CpG-DNA/HMGB1囊泡广泛共定位。（E） rHMGB1的加入增加了HMGB1与TLR9的共定位。如图所示，不同量的rHMGB1与wt和HMGB1缺陷巨噬细胞（IFLMD）孵育10分钟。测定了TLR9与HMGB1的显色作用。（F） HMGB1转移到含有ERGIC-53的囊泡可以被LMB阻断，并被外源性rHMGB1恢复。BMDM被饥饿3小时，然后用LMB治疗或不治疗60分钟。在存在或不存在LMB的情况下，用CpG-ODN（10μg/mL）或rHMBG1（50 ng/mL）培养细胞10分钟。
图6
图6
HMGB1加速巨噬细胞TLR9对CpG-ODN的早期内体易位用CpG-ODN-Cy5（1018，5μg/mL）处理（A，B）Wt（顶面板）和HMGB1缺陷（底面板）IFLDM（A）或PFLDM（B）0，5，15或30分钟。细胞固定、渗透，并用抗TLR9/FITC和抗EEA1/罗丹明染色。通过间接免疫荧光获得共聚焦图像。
图7
图7
CpG-ODN反应受损嗯1−/−细胞（A）重量和嗯1−/−永生化或原代造血祖细胞（HPCs）在GM-CSF培养7天后表达DC标记物CD11b和CD11c，或在巨噬细胞培养10天后表达CD11b及F4/80。尽管HPCs是均匀圆形且不粘附的，但在分化后，它们会粘附并获得巨噬细胞样形态。（IFLDC表示来源于永生化胎肝的DC。HPC；PFLDC，来源于原代胎肝HPC的DC。）（B）重量和重量中HMGB1、TLR9和肌动蛋白的蛋白质水平嗯1−/−IFLDC。（C） 重量和嗯1−/−IFLDS内吞了相当水平的CpG-ODN或GpG-ODN。用CpG-ODN-Cy5（0.1或1.0μg/mL，持续1小时，左侧面板）、CpG-ODN-Cy6（1018、10或100 nM）或GpG-ODN-Cy5，在指定的时间点（右侧面板）处理细胞，然后进行FACS分析。（D） 野生型和嗯1−/−IFLDM以1×10的比例播种5/孔（一式三份），并用CpG-ODN（1018，10至1000 nM）、LPS（0.1μg/mL）或PGN（10μg/mL）处理。24小时后，通过ELISA评估IL-6分泌（bars表示三倍±SD的平均值）。实验重复了3次。（E） 重量和嗯1−/−IFLDCs的种子为1×105/在96 well板中进行处理（一式三份），并用CpG-ODN（1018，1至1000 nM）、LPS（0.1μg/mL）或PGN（10μg/mL）处理。24小时后，通过ELISA评估IL-6、IL-12和TNFα分泌（条形代表三倍±SD的平均值）。实验重复5次。（F） 重量和嗯1−/−IFLDC的播种量为1×105/在96-well板中（一式三份），在DOTAP（10μg/mL）或LPS（0.01或0.1μg/mL，底板）存在或不存在的情况下，用CpG-a（2216，1至1000 nM，顶板）或CpG-ODN（1018，0.1或1.0μg/mL（底板）处理，或不处理。24小时后，通过ELISA评估IL-12（顶部面板）或IL-6（底部面板）分泌（条形代表三倍±SD的平均值）。（G） 重量和嗯1−/−PFLDC的播种量为0.8×105/孔（一式三份），在有或无DOTAP（10μg/mL）或LPS（0.1μg/mL）的情况下，用CpG-ODN（1018、100或1000 nM）或CpG-a（2216、100或1000nM）处理，或不处理。24小时后，通过ELISA评估IL-6和IL-12的分泌（条形代表三倍±SD的平均值）。ND：未检测到。（H） 重量和嗯1−/−用CpG-B（1018，10μg/mL）、CpG-A（2216，3.3μg/mL。通过对水疱性口炎病毒的生物检测，检测上清液样品中的1型干扰素生物活性。（一） 用CpG-ODN（1018，10μg/mL）或LPS（1μg/mL嗯1−/−国际最不发达国家联合会回应CpG-ODN。rHMGB1（rH1，0.2μg/mL）在存在或不存在CpG ODN（1018）的情况下孵育15分钟。重量和嗯1−/−IFLDS用CpG-ODN（1018、1或10μg/mL）±rHMGB1、LPS（0.1μg/mL。
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