In situ measurement of the electrical potential across the phagosomal membrane using FRET and its contribution to the proton-motive force

doi:10.1073/pnas.0700783104

.2007年5月29日；104(22):9523-8.

doi:10.1073/pnas.0700783104。 Epub 2007年5月21日。

FRET原位测量吞噬体膜电位及其对质子动力的贡献

本杰明·斯坦伯格¹, 尼古拉斯·图雷特, 玛丽亚娜·瓦尔加斯·卡巴列罗, 塞尔吉奥·格林斯坦

附属公司

PMID： 17517624
预防性维修识别码：项目经理1890527
内政部： 10.1073/pnas.0700783104

FRET原位测量吞噬体膜电位及其对质子动力的贡献

本杰明·斯坦伯格等。美国国家科学院程序. 2007.

.2007年5月29日；104(22):9523-8.

doi:10.1073/pnas.0700783104。 Epub 2007年5月21日。

作者

本杰明·斯坦伯格¹, 尼古拉斯·图雷特, 玛丽亚娜·瓦尔加斯·卡巴列罗, 塞尔吉奥·格林斯坦

隶属关系

¹加拿大安大略省多伦多市儿童医院细胞生物学项目。

PMID： 17517624
预防性维修识别码：项目经理1890527
内政部： 10.1073/pnas.0700783104

摘要

噬菌体利用裂解酶、阳离子肽和活性氧中间体来消除入侵微生物。吞噬体膜上H（+）泵真空型ATP酶（V-ATP酶）产生的酸性pH值增强了这些杀菌机制的效力。嗜中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞的吞噬体酸化程度差异很大，可能受到囊性纤维化等疾病的影响。吞噬体pH值的决定因素尚不完全清楚，但对中和V-ATP酶的电效应的离子的渗透性被认为起着关键作用。当反离子电导受到限制时，大膜电位的产生将主导质子动力（pmf），pH梯度也会相应减小。这一概念的验证需要直接测量吞噬体膜上形成的电势（Psi（Phi））。我们描述了一种基于荧光共振能量转移的非侵入性方法来估计完整细胞中的Psi（Phi）。这种方法结合吞噬体pH值的测量，使我们能够计算小鼠巨噬细胞吞噬体的pmf，并分析限制酸化的因素。在稳定状态下，Psi（Phi）平均为27 mV（流明阳性），仅通过用康那霉素A抑制V-ATP酶而部分消散。电位对pmf的贡献相对较小，表明质子泵不受反离子渗透性的限制，这一概念通过使用离子载体独立验证。相反，当质子泵速率（随着管腔酸化而逐渐降低）与质子当量的被动泄漏相匹配时，吞噬体pH值稳定。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
FRET供体和受体的特征。(A类)用DACCA的琥珀酰酯衍生物孵育标记sRBC。(B)DACCA的激发（固体）和发射（点）光谱：sRBC（黑色）和oxonol（灰色）。灰色条表示用于可视化FRET的激励和发射带宽。(C类和D类)盖玻片上标记的sRBC与(C类)或不带(D类)DiBAC公司₄(5). 在DACCA、DiBAC中采集的图像₄（5），或cFRET通道，以及相应的差分干涉对比显微镜（DIC）图像。（比例尺：10μm）

**图2。**
活巨噬细胞中的FRET。允许RAW细胞内化任一标记的(*A–C*)或未标记(*D–F型*)sRBC，与250 nM DiBAC平衡₄（5）、和图像。驾驶员信息中心(A类和D类)，接受者(B和E类)和cFRET(C类和F类)给出了一个典型场的荧光图像。DiBAC公司₄（5）分布于整个巨噬细胞(B和E类)与cFRET相比，cFRET仅限于吞噬体(C类). 这个插图在里面C类和F类显示供体信号。（比例尺：10μm）

**图3。**
咽粘膜电位测量。(A类)用于计算Ψ的变量_Φ该系统由细胞外（隔室1）、细胞内（隔室2）和吞噬体内（隔室3）空间组成。游离DiBAC的浓度₄（5）在每个隔间中显示为C_x个，其中x个表示隔间。隔室1和隔室2由质膜分隔，隔室2和隔室3由吞噬体膜分隔，每个隔室的跨膜电位为Ψ_颗粒物和Ψ_Φ,分别是。(B)用于计算C的外部校准_三从游离DACCA:sRBC中记录.cFRET，同时滴定更多的DiBAC₄(5). 然后将吞噬体内测得的cFRET量转化为吞噬体内的DiBAC₄（5）浓度（C_三)通过使用经验生成的校准曲线。每个数据点代表14个单独校准的平均值±SEM；用于插值C的对数最小二乘最佳拟合_三测量的cFRET值用虚线表示。(C类) Ψ_颗粒物使用DiBAC进行测量₄（5）（填充钢筋；n个=10个实验）和电流钳模式下的细胞贴附膜片钳记录（开条，n个=三个实验中的10个细胞）。DiBAC的代表性校准曲线₄（5）荧光与Ψ_颗粒物如所示SI图6. (D类)两种不同的细胞外DiBAC₄（5）在吞噬DACCA后，将浓度添加到RAW细胞中：测量sRBC和cFRET。数据说明了Ψ_Φ使用125 nM（填充钢筋）和250 nM DiBAC测量₄（5）添加1μM康那霉素A之前（基线）和之后（开条）。数据分别为从左至右的8、24、5和6个实验的平均值±SEM。星号表示具有统计显著性(*P（P）*<0.05）与相应基线的差异，通过使用未配对计算t吨测验。

**图4。**
V-ATP酶的能量学。FITC-标记sRBC(A类)添加到RAW细胞中作为吞噬猎物(插入)用于吞噬体pH值测量。吞噬作用持续5分钟，然后在比率成像前进行15分钟的成熟期。获取实验数据后就地进行了校准。代表性校准曲线如所示B.平均基线管腔pH值为5.22±0.03(n个=37个实验）。(C类)单个吞噬体的典型pH值曲线。在获得基线pH值后，添加康那霉素A以抑制V-ATP酶，并监测pH值的增加。天然气₄添加Cl（2 mM）使吞噬体暂时碱化，以计算缓冲力，然后就地校准。(D类)允许噬菌体形成并达到稳定pH值。接下来，如箭头所示，通过添加1μM康那霉素a抑制V-ATP酶，并以指定浓度添加FCCP，如记录所示。痕迹代表每种条件下的三到五次实验。(E类)碱化率与FCCP浓度的关系，如D类数据是至少三个单独实验中≥25个吞噬体的平均值±SEM。(插入)数据的Eadie-Hofstee线性化。

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