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.2007年5月15日；104(20):8455-60.
doi:10.1073/pnas.0609699104。 Epub 2007年5月9日。

小分子拮抗剂对GLI介导的转录和肿瘤细胞生长的抑制作用

马蒂亚斯·劳斯 1, 阿萨·伯格斯特伦, 岛川隆, 符文托夫特
附属公司

小分子拮抗剂对GLI介导的转录和肿瘤细胞生长的抑制作用

马蒂亚斯·劳斯等。 美国国家科学院程序. .

摘要

发育中重要的Hedgehog（Hh）信号通路最近与多种形式的实体癌有关。目前的药物开发计划侧重于靶向原癌基因Smoothened，一种关键的跨膜途径成员。这些候选药物虽然前景看好，但并未解决Smoothened下游发生通路激活的情况，如髓母细胞瘤、胶质瘤、外皮细胞瘤、乳腺癌和前列腺癌。GLI介导转录的小分子拮抗剂是Hh途径的最后一步，通过细胞筛选发现两种分子能够选择性抑制GLI介介导的基因转录激活。我们提供了这些化合物阻断下游通路的遗传证据，并证明了上游拮抗剂如环胺在这种情况下的无效性。从机制上讲，这两种抑制剂都作用于细胞核以阻止GLI功能，其中一种干扰活细胞中GLI1 DNA的结合。重要的是，所发现的化合物以依赖GLI的方式有效抑制体外肿瘤细胞增殖，并成功阻止体内异种移植模型中的细胞生长，该模型使用Hh通路下游激活的人类前列腺癌细胞。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突声明：抑制剂是已提交专利申请的主题。

数字

图1。
图1。
抑制转染HEK293细胞中GLI诱导的转录。(一个)识别小分子GLI拮抗剂的复合筛选示意图。GliBS，Gli结合位点；Luc，萤火虫荧光素酶。右上角给出了两次命中的结构，即GANT61和GANT58。(B类)GLI1抑制。(C类)GLI2（ΔN-GLI2）抑制。将SUFU（SF）作为阳性对照进行共转染。为了在所有孔中实现相同的转染效率，转染在大平板上进行，然后在较小的孔上分裂并处理。所有值均归一化为总蛋白量。处理时间为24小时，对照细胞仅用二甲基亚砜处理。显示的是三个独立实验的平均值。误差条指示SD。
图2。
图2。
抑制内源性Hh信号。(一个)SAG处理的Shh-L2细胞中GANT61和GANT58与环胺（Cyclo）的剂量-反应曲线比较。这三种化合物都能抑制Hh信号传导。治疗时间为48小时，正常化为雷尼利亚荧光素酶。与未经SAG处理的细胞相比，Hh报告活性增加了一倍。(B类)Ptch1中Gli1 mRNA水平的定量PCR测定−/−MEF（与野生型MEF相比的折叠诱导）。用10μM化合物处理融合细胞2–3天。数据归一化为Gapdh表达。(C类)用化合物和SAG处理4天后，抑制SAG诱导的C3H10T1/2细胞碱性磷酸酶表达。将数值归一化为总蛋白质量。所示为与未经SAG处理的细胞相比的折叠碱性磷酸酶诱导。所有实验至少重复三次。错误条显示SD。
图3。
图3。
Hh途径的下游抑制。(一个和B类)Gli1 mRNA的定量RT-PCR(一个)和Hip1 mRNA(B类)在苏福−/−用所示化合物处理MEF 3天。结果根据Gapdh mRNA水平进行标准化。所示为与苏福相比的倍数增加+/+MEF公司(n个=至少三个，错误栏显示SD）。(A插图)免疫印迹法验证苏芙中苏芙蛋白的缺失−/−细胞。(C类)苏福Hip1蛋白印迹−/−用10μM化合物处理的MEF。
图4。
图4。
抑制依赖GLI的人类肿瘤细胞生长。(一个)用5μM化合物处理48小时后，GAPDH在22Rv1和PANC1细胞中标准化GLI1和PTCH表达的变化(B类)通过BrdU掺入测定的细胞增殖抑制。所示为与DMSO处理样品相比，BrdU掺入的抑制百分比(n个=≥4，误差条=表示SD）。
图5。
图5。
人类前列腺癌异种移植物。(一个)治疗期间肿瘤体积的变化。注入时间点如曲线上方的箭头所示。(B类)治疗开始（第0天）和治疗结束（第18天）时异种移植物的大体外观。在GANT61治疗的动物中未发现肿瘤（图片中的隆起部分是胸腔的一部分）。(C类)通过定量PCR对治疗的22Rv1肿瘤中PTCH mRNA的定量。根据GAPDH标准化值。所示为每种治疗中两种肿瘤的分析平均值。
图6。
图6。
抑制GLI1 DNA结合。(左上)EMSA。将化合物添加到GLI1转染的HEK293细胞的全细胞裂解物中(在体外). (左下方)两个独立EMSA实验的平均带强度。(右上)EMSA。将化合物添加到培养的Flag-GLI1转染的HEK293细胞中(体内)24小时后制备全细胞裂解物。将裂解液输入归一化为相等的GLI1负荷。(插入)使用α-Flag的Western blot（WB）。(右下角)两种独立的裂解液制剂和EMSA实验的平均谱带强度。GliBS，Gli结合位点。
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