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.2007年6月5日；17(11):911-21.
doi:10.1016/j.cub.2007.04.040。 Epub 2007年5月10日。

BDNF信号的遗传调制影响体内轴突竞争的结果

曹璐祥 1, 阿列菲亚·迪拉, Jun Mukai先生, 理查德·布拉泽斯基, 克劳迪娅·洛多维奇, 卡罗尔·A·梅森, 约瑟夫·戈戈斯
附属公司

BDNF信号的遗传调制影响体内轴突竞争的结果

曹鲁香等。 当前生物. .

摘要

背景：作用于分支稳定性或形成的活动依赖性竞争在形成轴突终末乔木的模式和复杂性方面起着关键作用。在哺乳动物中枢神经系统（CNS）中，活动依赖性竞争对轴突树状结构和感觉图谱的组装的影响已得到很好的证实。然而，在竞争环境中调节轴突分支稳定性或形成的分子途径仍然未知。

结果：我们通过采用一种允许抑制嗅觉感觉神经元随机亚群（OSN）中神经分泌活性的遗传策略，在小鼠嗅觉系统中建立了体内轴突竞争范式。长期随访证实，这种基因操纵通过揭示活性乔木的选择性稳定和突触沉默乔木的局部退化而引发竞争。通过使用一组转基因小鼠模型，我们证明，无论是总水平还是活性依赖性分泌的BDNF水平的降低（由于val66met替代），都可以使沉默的乔木免于枯萎。我们表明，这种效应可能至少部分由p75（NTR）介导。

结论：我们在哺乳动物中枢神经系统中建立并实验验证了体内遗传轴突竞争范式。通过使用这一范式，我们为BDNF信号在体内竞争条件下对末端乔木修剪的特定影响提供了证据。我们的研究结果对嗅觉和其他感官图谱的形成和完善，以及BDNF val66met变异体调节的神经精神疾病和特征具有指导意义。

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数字

图1
图1。LF-和HF-TeTxLC线路的终端乔木复杂性
（A）触发竞争的基因策略。破伤风毒素轻链（TeTxLC）在嗅觉感觉神经元中诱导表达的示意图。含有OMP IRES tTA和tetO-TeTxLC IRES tau-lacZ等位基因的复合杂合子将在缺乏强力霉素的情况下表达破伤风毒素和tau-lacZ，并在LF TeTxLC中触发竞争，但在HF TeTxLC系中不触发竞争。LF-TeTxLC和HF-TeTxLC线的嗅球和嗅上皮的代表性低倍图像显示在底部。（B）在低频表达TeTxLC和tauLacZ的转基因小鼠（LF-TeTxLC，底部面板）或仅表达tauLac Z的对照小鼠（LF-tauLacZ，顶部面板）中，描述OSN轴突终末轴生后发育（P6-P30）的样本图像。在每个面板中，一个标记有抗β-半乳糖抗体的轴突轴索以绿色显示。在出生后第0、4、6、10、14和30天的准备工作中，我们使用共焦显微镜介导重建单个OSN轴突的终末轴索。在三个独立建立的LF-TeTxLC品系中观察到相同的端乔木修剪模式（数据未显示）。P14/LF-TeTxLC图像中的插页描绘了一个野生型DiI-标记（红色）的活动轴突轴索，代表P14处LF-TeTxLC线中的大多数轴突轴索索。由于观察到相邻β-gal或DiI阳性轴突的概率低得令人望而却步，我们无法确定突触沉默的轴突的退出是否伴随着其活动邻居的扩张。比例尺，20μm。（C、D）LF-TeTTxLC小鼠OSN轴突末端乔木复杂性的评估(n个=5），或对照LF-tauLacZ小鼠(n个= 5). 分析了轴生乔木的每株分枝点数（C）和每株总分枝长度（D）。对每只动物至少10个轴突轴进行扫描、重建和定量分析。（E）图像描绘了在超过70-80%的OSN（HF-TeTxLC）中以高频表达TeTxLC和tauLacZ的转基因小鼠或仅以高频表达tauLac Z的对照小鼠（HF-tauLacZ）中OSN轴突终末轴的出生后发育（P6-P30）（顶面板）。在每个面板中，一个标有亲脂性示踪剂DiI的乔木以红色显示。比例尺为20μm。（F、G）HF-TeTxLC小鼠OSN轴突末端乔木复杂性的评估(n个=5），或对照HF-tauLacZ小鼠(n个= 5). 对每只动物至少10个顶芽乔木进行分析，以确定每株乔木的分枝点数（F）和总分枝长度（G）。结果以平均值±S.M.E.表示。单个星号表示P（P）<0.05和双星号表示P<0.01。选取样本图像作为乔木复杂度变化的代表。
图2
图2。NMDA受体活性在顶极乔木间的竞争中起着允许的作用
（A）在P6-P10期间全身给药MK-801或生理盐水后，描绘LF-TeTxLC（顶面板）、对照tauLacZ（中面板）和HF-TeTxLC（底面板）转基因小鼠中OSN轴突终末轴的命运的样本图像。如图所示，对最后一次注射后的两个时间点进行了检查。请注意，MK-801给药终止后，MK-81-给药小鼠的单个轴突轴索未能显示在经盐处理或未经盐处理的LF-TeTxLC小鼠中观察到的复杂性显著降低。相比之下，停止MK-801给药并清除药物四周后，出现简单的终末退化。比例尺，20μm。（B、C）tauLacZ对照小鼠ORN轴突终末轴索复杂性分析(n个=6），LF-TeTxLC(n个=5）小鼠和HF-TeTxLC(n个=5）在P6-P10期间接受MK-801注射，并在注射后4天或4周进行检查。B： 分支点数量；C： 总分支长度。单个星号表示P（P）<0.05和双星号表示P（P）< 0.01.
图3
图3。竞争导致非活动分支的局部退化
（A）LF-TeTxLC转基因小鼠的OSN轴突终末轴索的图像，携带椭圆形或球形的大轴突静脉曲张（LAV，用白色箭头表示）。比例尺：20μm（B）LF-TeTxLC小鼠末端纹状体LAV的频率分布(n个=78个乔木）和对照LF-tauLacZ小鼠(n个=60个乔木）。请注意这两种分布之间的显著差异。（C）LF-TeTxLC小鼠和对照LF-tauLacZ小鼠的OSN轴突终轴中LAVs的密度（每100μm的数量）。双星号表示P（P）< 0.01.（D）LF-tauLacZ（a-d）和LF-TeTxLC（e-k）乔木末端的超微结构分析。由100μm（两个面板和h左面板）或10μm（a和h右面板）肾小球内嗅觉感觉乔木的塑料嵌入部分制成的Lucida相机图纸（虚线表示边界）。图（b）所示为肾小球内具有代表性的轴突树突，在100μm厚的切片上用抗β-半乳糖抗体进行相位显微镜观察。在这两种基因型中，标记的圆形静脉曲张（在a中画c；在e中画f）在肾小球内形成典型的嗅觉感觉轴突接触（c，f），而LAV（在a里画d；在e里画g；在h里画i）显示退化的细胞学征象（d，g，i-k）。在c、d和f中，箭头表示突触；箭头指向多泡体（mv）和吞噬结构；ax：β-gal阳性轴突终末；den：树枝晶。
图4
图4。BDNF水平影响竞争驱动的末端轴突树突化
（A）OB中BDNF免疫反应性（绿色信号）。在二尖瓣细胞和肾小球周围细胞的胞体以及肾小球内均检测到BDNF免疫反应性，但在嗅上皮中未检测到（未显示）。MCL：二尖瓣细胞层；EPL：外丛状层；GL：肾小球层。比例尺，50μm。（B）在LF-TeTxLC（顶面板）、对照LF-tauLacZ（中间）或HF-TeTxLC（底部）转基因正常小鼠中，描述OSN轴突终末轴索命运的样本图像(BDNF公司 (+/+))，或半正常(BDNF公司 (+/-))P14处的BDNF水平。请注意，选择的样本图像代表了乔木复杂性的变化，而不是LAV的数量。比例尺，20μm。（C、D）tauLacZ对照小鼠、LF-TeTxLC或HF-TeTxLC小鼠中OSN末端乔木复杂性的定量BDNF公司 (+/+)或BDNF公司 (+/-)P14时的小鼠（每个基因型6只）。C： 分支点数量；D： 总分支长度。（E）OSN终端乔木LAV密度分析BDNF公司 (+/+)，或BDNF公司 (+/-); LF-TeTxLC小鼠以及野生型tauLacZ对照小鼠。单个星号表示P（P）<0.05和双星号表示P（P）< 0.01.
图5
图5。BDNF公司遇见变异影响竞争驱动的末端轴突树状化
（A）跨越小鼠的小鼠基因组DNA（用红色表示）BDNF公司将包含侧翼序列11 kb上游和3 kb下游的基因克隆到自激pACN/neo盒中。这个BDNF公司遇见和BDNF公司val值通过将小鼠编码序列替换为相应的274bp长的同源人类序列（以蓝色显示）来生成靶向结构，该序列携带val或met等位基因。由于小鼠和人类的蛋白质在11个氨基酸残基上存在差异，所有这些氨基酸残基都位于交换的274 bp区域内，这种基因操作基本上使小鼠的整个编码区域“人性化”BDNF公司基因，从而产生两种转基因小鼠菌株，其中人类BDNF公司遇见或BDNF公司val值内源性小鼠对基因转录的调节BDNF公司监管要素。通过Southern印迹和杂交，使用诊断性Mfe1限制性消化物和位置标记为橙色框的探针，确认了靶向胚胎干细胞克隆中的同源重组。显示预测片段（5.9 kb或3.8 kb），Southern blot分析结果显示在底部面板（左侧）。使用Pml1对来自尾部活检样本的DNA进行诊断性限制性内切酶分析BDNF公司（满足/+）和BDNF公司（val/+）底部面板（中间）也显示了杂合敲除小鼠。制备的OB提取物中BDNF的总含量BDNF公司（见过/见过）和BDNF公司（val/val）和室友BDNF公司 (+/+)底部面板（右侧）中还显示了对照组小鼠和一个典型的Western blot。BDNF总水平与野生型相当BDNF公司 (+/+)室友；将数据归一化为β-肌动蛋白，并表示每组5只小鼠归一化光密度的平均±S.E.M。（B）描述野生型LF-TeTxLC（顶面板）、对照LF-tauLacZ（底面板）中OSN轴突终末轴索命运的样本图像，BDNF公司（见过/见过）和BDNF公司（val/val）P14敲除小鼠。比例尺，20μm。（C、D）对照LF-tauLacZ和LF-TeTxLC小鼠OSN末端乔木复杂性的定量BDNF公司（满足/满足）和BDNF公司（val/val）和室友一样BDNF公司 (+/+)对照小鼠(n个=每个基因型5只小鼠）。C： 分支点数量；D： 总分支长度。注意野生型小鼠的结果BDNF公司 (+/+)来自两个杂交组合的同窝小鼠被合并，因为它们表现出相同的末端树状化模式。（E）OSN终端乔木LAV密度分析BDNF公司（见过/见过）和BDNF公司（val/val）和室友一样BDNF公司 (+/+)对照小鼠与LF-TeTxLC或LF-tauLacZ系杂交。双星号表示P（P）< 0.01.
图6
图6。p75（NTR）水平影响竞争驱动的末端轴突树突化
（A）OB中p75（NTR）免疫反应性（绿色信号）。p75（NTR）免疫反应在肾小球内以及一些肾小球周细胞（代表箭头）和套膜胶质细胞（星号）的胞体中检测到。注意二尖瓣细胞层没有免疫反应。MCL：二尖瓣细胞层；EPL：外丛状层；GL：肾小球层；ONL：外神经层。比例尺，50μm。（B）在LF-TeTxLC（顶部面板）、对照野生型（中间面板）或HF-TeTxLC（底部面板）转基因小鼠中，在有或无第75页（NTR）突变，位于P14。比例尺，20μm。（C、D）对照小鼠、LF-TeTxLC或HF-TeTxLC转基因小鼠中OSN末端乔木复杂性的定量第75页（NTR） (+/-)，纯合子第75页（NTR） (-/-)或野生型第75页（NTR） (+/+)(n个=每个基因型6只小鼠）。C： 分支点数量；D： 总分支长度。（E）OSN终端乔木LAV密度分析第75页(+/+)或第75页(-/-); LF-TeTxLC小鼠。单个星号表示P（P）<0.05和双星号表示P<0.01。
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