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.2007年4月19日；54(2):205-18.
doi:10.1016/j.neuron.2007.03.005。

表达通道视紫红质-2转基因小鼠体内光诱导神经回路激活

本杰明·阿伦基尔 1, 若昂·佩卡, 伊恩·戴维森, 费利西亚诺猫, 卡尔·戴瑟罗, 乔治·奥古斯丁, 迈克尔·D·埃勒斯, 冯国平
附属公司

表达通道视紫红质-2转基因小鼠体内光诱导神经回路激活

本杰明·阿伦基尔等。 神经元. .

摘要

通道视紫红质-2（ChR2）是一种从绿藻莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中分离出来的光门控、阳离子选择性离子通道。在这里，我们报道了在CNS中表达ChR2-YFP融合蛋白的转基因小鼠的产生，用于体内激活和绘制神经回路。使用大脑皮层和嗅球的焦点照明，我们证明了神经元的高度可重复、依赖光的激活以及体内放电频率的精确控制。为了测试绘制神经回路的可行性，我们利用麻醉小鼠的嗅球和梨状皮质之间形成的回路。在嗅球中，单个二尖瓣细胞对光产生动作电位，其放电速率不受共刺激肾小球的影响。然而，在梨状皮层，当灯泡的较大区域被照明以补充额外的肾小球时，目标神经元的活动增加。这些结果支持了一种嗅觉加工模型，该模型依赖于二尖瓣细胞与皮层细胞的融合和整合。更广泛地说，这些发现证明了一种用光精确操纵完整哺乳动物大脑神经活动的系统，并说明了ChR2小鼠在探索体内复杂神经回路的功能连通性方面的用途。

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数字

图1
图1。这个您的1启动子驱动ChR2-YFP在中枢神经系统神经元亚群中的转基因表达
（A） 的示意图Thy1-ChR2-YFP转基因构建。（B） ChR2-YFP表达的全脑图像您的1转基因小鼠大脑，显示了（C）-（E）所示截面的冠状面。（C） 冠状切面通过Thy1-ChR2-YFP转基因小鼠大脑。CB，小脑；理学学士，脑干。（D） 通过Thy1-ChR2-YFP转基因小鼠大脑。CTX，皮层；HP，海马体。（E） 免疫增强切片使用抗GFP抗体放大嗅球二尖瓣细胞中的ChR2-YFP检测。星号表示顶端树突从二尖瓣细胞体延伸，在肾小球层形成簇状突起。（F） （E）所示截面的DAPI染色，突出显示嗅球的细胞层。GL，肾小球层；EPL，外丛状层；ML，二尖瓣细胞层。（G） 以2μm的间隔通过嗅球进行连续z切片Thy1-ChR2-YFP显示ChR2-YFP定位于二尖瓣细胞质膜的小鼠。顶部面板显示截面的串行z平面中的ChR2-YFP表达式。底部面板显示了相应的切面，二尖瓣细胞体和外侧树突与针对二尖瓣上皮细胞表达的5-HT2A受体（紫色）和ChR2-YFP（绿色）的抗体混贴。箭头指向外侧树突膜上的ChR2-YFP表达。箭头指向二尖瓣细胞体膜上的ChR2-YFP表达。EPL，外丛状层；ML，二尖瓣细胞层；GC，颗粒细胞层。（H–J）在嗅球内，ChR2-YFP在二尖瓣细胞中选择性表达。（H） 二尖瓣细胞层ChR2-YFP表达的高度放大视图。（一） 膜结合的ChR2-YFP（绿色）和5-HT2A受体（蓝色）的染色，二尖瓣细胞的标记物。（J） ChR2-YFP在GAD67阳性颗粒细胞（红色）中不表达。注意二尖瓣细胞上存在膜定位的ChR2-YFP（长箭头），较小的GAD67阳性颗粒细胞（箭头）上没有ChR2-YFP。MC，二尖瓣细胞；GC，颗粒细胞。比例尺，2.5 mm（B）；1毫米（C和D）；50μm（E和F）；10微米（G）；10μm（H–J）。
图2
图2。转基因表达的ChR2在急性脑切片中产生快速、光诱发的细胞类型特异性反应
（A） 用488 nm的光照射，在电压钳制的二尖瓣细胞中，从主嗅球片产生具有瞬态和持续成分的快速光电流。电流是根据2（迹线1）、4（迹线2）和20（迹线3）mW/mm的分级照明强度显示的2（B）短暂的5 ms光照在电流钳记录的二尖瓣细胞中产生可重复的EPSP样事件，这些阈下反应以光强度分级（黑色和深灰色痕迹）。较高的光强度产生短延迟动作电位触发（浅灰色轨迹，截断）。尖峰后观察到的显著后超极化（AHP）是典型的二尖瓣细胞。黑色痕迹，低强度光（2 mW/mm2); 深灰色，中等强度（4 mW/mm2); 浅灰色，高强度（20 mW/mm2). 叠加每个强度下对照明的三个重复响应。（C） 快速光电流动力学（黑色，底部迹线）允许精确和可再现地控制动作电位触发（灰色，顶部迹线）。左侧，由5毫秒光脉冲诱发的六个单棘波叠加。右，由一系列脉冲（5 ms，40 Hz）诱发的三个尖峰序列的叠加。粗灰色条表示照明周期。（D） （a）主嗅球中的二尖瓣/簇状（M/T）细胞始终显示出由ChR2介导的光电流（黑色，中间面板），该光电流驱动强烈的神经元放电（灰色，顶部面板）。（b和c）MOB肾小球周围（PG）和颗粒细胞（GC）中间神经元（顶部和中间面板）无光激发活性，尽管电流注入仍容易驱动峰值（底部面板）。（E） MOB中不同神经元类型的峰值光诱发电流振幅。ChR2光电流仅在MOB的二尖瓣/簇状（M/T）细胞中观察到。PG，肾小球周细胞；GC，颗粒细胞。条形图显示平均值±SEM。
图3
图3。表达ChR2的第5层皮层神经元的体内光激活
（A） 体内光传递和电生理记录系统的图示。（B–D）记录单个单位对不同光刺激模式响应的尖峰活动的示例轨迹。（B） 三次500 ms曝光的峰值响应间隔500 ms。（C） 对单个4s曝光的峰值响应。（D） 三次20 Hz刺激的峰值响应。请注意传递的照明和记录的峰值之间的精确时间对应关系。
图4
图4。ChR2在体内产生暂时精确的光激发神经活动
（A） 短暂的光脉冲产生皮层锥体神经元快速而一致的放电。五次刺激呈现的细胞外峰值。中间，同一神经元对100次重复陈述的反应的光栅图。底部，峰值时间与光照开始时间的直方图显示了整个试验时间的可靠性。灰色条表示照明时间。（B） 11个神经元的光诱导反应潜伏期直方图。第一次峰值的平均时间为9.9±2.2 ms（±SD）。（C） 单个神经元在很宽的频率范围内可靠地跟随刺激序列。左边是以10到50赫兹的频率重复刺激序列的反应光栅图（每次10次试验）。没错，对于10至40 Hz的刺激频率（n=8；50Hz时n=5），尖峰产生非常可靠。（D和E）持续照明会在较长时间内产生持续的高频放电。（D） 500 ms光照诱发的平均放电率为64±17 Hz。n=4个神经元。（E） 顶部，从一个细胞发出的尖峰序列被照亮1s。底部，绘制了不同照明周期的发射率。图中的线表示不同的照明持续时间。实线，100 ms；虚线，200毫秒；虚线，500 ms；宽虚线，1s。（C）和（D）中的条显示±SEM。
图5
图5。照亮嗅球背表面促进ChR2-YFP小鼠二尖瓣细胞尖峰活动
（A） 暴露的背侧嗅球在广泛照明下成像以检测ChR2-YFP发射。（B） 光激活二尖瓣细胞的电生理痕迹示例，突出了在光照期间显著增加的呼吸耦合尖峰活动。（C） 暴露的背嗅球图像显示了使用直径100μm的光纤实现的光刺激区域。（D） 四个250ms光脉冲后单个二尖瓣单元的尖峰反应。（E） 暴露的背嗅球图像显示了使用直径300μm的光纤束实现的光刺激区域。比例尺，1 mm（A、C和E）。（F） 如（D）所示，从同一站点记录的两个不同单元的峰值响应。另一个细胞活性的补充（绿色尖峰轨迹）不会影响原始细胞的放电特性（黑色尖峰轨迹，也可参见[D]）。（G和H）轨迹表示用于分类和单元识别的尖峰形状轮廓。黑色波形代表在窄光下最初隔离的第一个单元，而叠加的绿色波形对应于在宽光刺激下招募的第二个单元。
图6
图6。个体二尖瓣细胞的反应不受嗅球光刺激面积增加的影响
（A和B）在背部嗅球的窄直径100μm（A）或宽直径300μm（B）的光照下，对同一细胞进行多次光刺激，得到刺激周时间直方图（PSTH）。用于生成PSTH的光栅扫描显示在每个面板的顶部。（C） 窄光或宽光刺激下细胞反应的分布图。显示了20项针对窄刺激和宽刺激的独立试验，覆盖了所分析的每个独立细胞。这两个红色星号表示使用Kolmogorov-Smirnov非参数双样本测试（限制为p值小于0.05）发现窄光照响应与宽光照响应存在显著差异的细胞。
图7
图7。需要广域光刺激嗅球来驱动梨状皮层的活动
（A–C）暴露的背嗅球图像，显示了使用（A）600μm、（B）300μm或（C）100μm光斑大小进行照明的相对光刺激区域。比例尺，1 mm（A、B和C）。（D） 数据表示刺激球茎不同区域（600μm直径斑点，7.01倍±0.78倍；300μm，2.40倍±0.24倍；100μm 1.26±0.14；每个n=20）导致梨状皮层细胞放电率高于基线的平均±SEM*p<0.001，单尾t检验。（E） 使用600μm、300μm或100μm直径光纤的单个皮层细胞响应。显示了基准射击速度。（F–H）具有代表性的PSTH（下部面板）和动作电位光栅图（顶部面板），显示梨状皮层神经元在时间零点使用直径为（F）600μm、（G）300μm或（H）100μm的光纤对灯泡照明的不同区域的反应。
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