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.2007年7月15日；405(2):369-78.
doi:10.1042/BJ20061873。

多梳蛋白Cbx4促进DNA甲基转移酶Dnmt3a的SUMO修饰

李冰冰 1, 荆州, 刘鹏（音）, 胡佳蕾, 洪进, 下野洋平, 高桥正藏, 徐国良
附属公司

多梳蛋白Cbx4促进DNA甲基转移酶Dnmt3a的SUMO修饰

李冰冰等。 生物化学杂志. .

摘要

“从头甲基转移酶”Dnmt3a（DNA甲基转移酶3a）已被证明可介导转录抑制。通过SUMO化对Dnmt3a进行翻译后修饰会影响其转录抑制能力。然而，关于SUMO化过程是如何调节的，我们知之甚少。在本研究中，我们鉴定了一种PcG（Polycomb group）蛋白Cbx4（chromobox 4），作为Dnmt3a的特异性相互作用伙伴。Cbx4和SUMO-1（小泛素相关修饰物-1）与Dnmt3a在转染细胞中的共表达导致Dnmt3a与SUMO-1的修饰增强。纯化的Cbx4在体外也促进Dnmt3a的SUMO化。修饰发生在N末端调控区，包括PWWP（Pro-Trp-Trp-Pro）域。我们的结果表明，Cbx4作为Dnmt3a的SUMO E3连接酶发挥作用，可能通过促进其SUMO修饰参与DNA甲基转移酶的功能调节。

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数字

图1
图1。Cbx4与Dnmt3a相互作用在体外和体内
(A类)Cbx4与Dnmt3a的直接相互作用：使用GST（通道2和5）或GST-Dnmt3a（通道3和6）从GST下拉分析中获得的组分中的His-tagged Cbx4Western blotting分析。大约10%的输入Cbx4被加载（车道1和4）。为了消除由污染核酸引起的假阳性相互作用的可能性，在下拉分析期间使用微球菌核酸酶（MNase）或溴化乙锭（EtBr）处理蛋白质制剂。(B)Dnmt3a与转染细胞表达的Cbx4共免疫沉淀（IP）。如顶部所示，用pcDNA3-HA-Dnmt3a和pFlag-CMV-Cbx4单独或联合瞬时转染HEK-293T细胞。用抗Flag抗体免疫沉淀全细胞提取物。如图所示，使用抗HA或抗Flag抗体通过Western blotting分析沉淀蛋白。(C)从转染细胞中用Dnmt3a共免疫沉淀Cbx4。用抗-HA抗体免疫沉淀的样品通过使用所示的抗-Cbx4或抗-HA抗体的蛋白质印迹进行分析。
图2
图2。Cbx4和Dnmt3a中相互作用域的映射
(A类)基于酵母双杂交分析数据的Cbx4片段及其Dnmt3a相互作用能力的示意图（右上图）（下图）。全长Dnmt3a与GAL4BD融合。将融合构建体与所指示的Cbx4部分共转化到酵母菌株AH109中，所述部分与GAL4AD融合。在缺乏亮氨酸、色氨酸、腺嘌呤和组氨酸的SD最小培养基（SD-L-T-A-H）上菌落的生长反映了Cbx4片段与Dnmt3a的正相互作用。保护区（色域和COOH框）用黑色阴影在条形图中表示。(B)基于酵母双杂交分析数据的Dnmt3a片段及其Cbx4相互作用能力的示意图（右上图）（下图）。将全长Cbx4融合到GAL4AD，并与Dnmt3a的指定部分共同转化为酵母菌株AH109，Dnmt4a与GAL4BD融合。在SD最小培养基（SD-L-T-A-H）上菌落的生长反映了积极的相互作用。
图3
图3。Dnmt3a特别与Cbx4相互作用
(A类)Cbx家族成员的COOH盒及其侧翼区域的氨基酸比对。相同的残基用黑色阴影表示，高度保守的残基用灰色阴影表示。(B)基于酵母双杂交分析数据的Cbx蛋白及其Dnmt3a相互作用能力的示意图（右上图）（中图）。将Cbx蛋白融合到GAL4AD并与GAL4BD–Dnmt3a共同转化为酵母菌株AH109。通过在SD最小培养基（SD-L-T-A-H）上生长菌落来获得相互作用。GAL4AD-Cbx和GAL4BD-Dnmt3a融合蛋白还分别含有HA或myc表位标签，用于通过Western blotting（底部）确认转化酵母中Cbx蛋白和Dnmt3a的表达。
图4
图4。Dnmt3a在HEK-293T细胞中被SUMOylated
(A类)Dnmt3a SUMO化的Western blotting分析。如顶部所示，用表达质粒瞬时转染HEK-293T细胞。用抗HA抗体（左侧）或抗Dnmt3a抗体（右侧）对细胞裂解产物进行Western blotting分析。显示了Dnmt3a及其SUMOylated形式的位置。(B)Dnmt3a SUMO化的免疫沉淀分析。如顶部所示，用表达质粒瞬时转染HEK-293T细胞。细胞提取物用抗HA抗体免疫沉淀。用抗Dnmt3a抗体（1和2道）、抗GFP抗体（3和4道）或抗HA抗体（5和6道）对沉淀蛋白进行Western blotting分析。显示了Dnmt3a及其SUMOylated形式的位置。
图5
图5。SUMO化所必需的Dnmt3a区域的映射
(A类)所用Dnmt3a缺失突变体的示意图概述。NLS序列用箭头表示。根据(B)并在右侧显示。(B)Dnmt3a缺失突变体SUMO化的Western blotting分析。用编码Dnmt3a不同区域的表达质粒瞬时转染HEK-293T细胞，如顶部所示。细胞裂解产物用抗HA抗体进行Western blotting分析。Dnmt3a碎片的SUMOylated形式的位置用箭头标记。箭头表示可能代表Dnmt3a翻译后修饰未知形式的附加带。
图6
图6。Cbx4增强Dnmt3a的SUMO化体内和在体外
(A类)Cbx4促进转染细胞中SUMO-1与CtBP的结合。如图所示，用编码Flag–SUMO-1、Flag-Cbx4和myc-CtBP的表达质粒瞬时转染HEK-293T细胞。使用抗myc（上面板）或抗Cbx4（下面板）抗体通过Western blotting分析细胞裂解产物。(B)Cbx4促进转染细胞中SUMO-1与Dnmt3a的结合。如图所示，用编码GFP–SUMO-1、Flag–Cbx4和HA–Dnmt3a的表达质粒瞬时转染HEK-293T细胞。使用抗HA（上面板）或抗Cbx4抗体（下面板）通过Western blotting分析细胞裂解产物。(C)Dnmt3a的SUM酰化在体外如图所示，在250 ng重组E1（Aos1/Uba2异二聚体）、100 ng重组E2（Ubc9）和3μg重组SUMO-1中培养纯化的GST-标记Dnmt3a（氨基酸1-482，GST-Dnmt3aN）。通过添加SDS负载缓冲液终止反应。使用抗GST抗体通过Western blotting分析蛋白质。(D类)Cbx4增强Dnmt3a的SUMO化在体外纯化的GST–Dnmt3aN与250 ng E1（Aos1/Uba2异二聚体）、20 ng E2（Ubc9）和3μg SUMO-1孵育。通道1-4分别含有0、25、50或100 ng纯化的His-Cbx4。请注意，此处使用的Ubc9数量比(C).
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