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.2007年9月13日；26(42):6133-40.
doi:10.1038/sj.onc.1210436。 Epub 2007年4月2日。

mir-29调控Mcl-1蛋白表达和细胞凋亡

J L莫特 1, S小林, S F布朗克, G J戈尔斯
附属公司

mir-29调控Mcl-1蛋白表达和细胞凋亡

J L莫特等。 癌基因. .

摘要

抗凋亡Bcl-2家族成员Mcl-1的细胞表达受到严格调控。最近，研究表明Bcl-2的表达受microRNA调节，microRNA是一种内源性小RNA分子，通过与信使RNA的序列特异性相互作用调节蛋白质表达。通过类比，我们推断Mcl-1的表达也可能受microRNAs调节。我们选择了人类永生但非恶性的H69胆管细胞和恶性KMCH胆管癌细胞系进行这些研究，因为Mcl-1在具有恶性表型的细胞中失调。通过电子分析，我们在mir-29家族的Mcl-1 mRNA中确定了一个假定的靶位点，并发现mir-29b在胆管细胞中高度表达。有趣的是，mir-29b在恶性细胞中下调，与Mcl-1蛋白上调一致。强化mir-29b表达降低了KMCH细胞中Mcl-1蛋白的表达。这种作用是直接的，因为mir-29b负调控了基于Mcl-13’非翻译区（UTR）的报告结构的表达。增强mir-29b表达可降低Mcl-1细胞蛋白水平，并使癌细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）的细胞毒性敏感。用锁定的核酸拮抗剂mir-29b转染非恶性细胞（表达高水平的mir-29）可增加Mcl-1水平并减少TRAIL介导的凋亡。因此，mir-29是Mcl-1蛋白表达的内源性调节因子，因此也是细胞凋亡的内源性调控因子。

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数字

图1
图1。Mcl-1信使RNA上推测的microRNA结合位点
面板a：Mcl-1 3'UTR（#NM_021960）核苷酸1184−4020示意图。预测有五种microRNA结合，与Mcl-1转录本的结合位置如括号所示。小组b：五种推测的Mcl-1结合microRNA的Northern blot。从H69细胞中分离富集小RNA（<200nt's）的RNA，并探测指示的小RNA。注意mir-29的稳健表达。转移前，尺寸标记来自SybrGreen染色凝胶；5.8S和5S是内源性rRNAs，26nt和18nt是指在相邻通道中运行的合成寡核苷酸。
图2
图2。mir-29b和Mcl-1的相互表达
a组：使用Mcl-1抗体检测永生化非恶性H69细胞和恶性KMCH细胞的总细胞蛋白。肌动蛋白被用作加载控制。图b：使用富集来自H69和KMCH细胞的小RNA的RNA对mir-29b进行Northern印迹。注意，KMCH细胞中的前体和成熟mir-29b均减少。作为负荷控制，使用针对小型家政RNA U6（106 nt）的RNA探针。c组：使用H69和KMCH细胞的总RNA对mir-29b进行定量RT-PCR。结果以每拷贝Z30 RNA的mir-29b拷贝数表示（平均+/-SEM；p<0.05）。
图3
图3。mir-29b负调控Mcl-1蛋白水平
a组：通过体外转录（补充方法）产生荧光标记前mir-29b，并转染到KMCH细胞。24小时后，用核染色DAPI对细胞进行反染色，并拍照。为了进行比较，显示了未转染的细胞。b组：与模拟转染细胞相比，使用来自转染20或50 nM前体mir-29b（非荧光标记）的KMCH细胞的小RNA进行Northern杂交。显示了成熟的加工形式（23nt），表明转染的RNA被加工。U6被探测为加载控制。c组：转染前体mir-29b的KMCH细胞中Mcl-1免疫反应。使用德克萨斯州红结合二级抗体，在共焦显微镜下拍摄细胞照片。d组：转染mir-29b表达载体（p29b）的KMCH细胞总细胞蛋白的Western blots。对照细胞转染1μg pCDNA，实验细胞转染0.5或1μg p29b。肌动蛋白被用作加载控制。e组：稳定转染p29b的KMCH细胞总RNA的Northern印迹。生成了两条线，K-mir-29−6和K-mir-29-19。内务RNA U6被探测为负载控制。面板f：KMCH、K-mir-29−6和K-mir-19总蛋白的Western blot（稳定过度表达mir-29b）。肌动蛋白被用作加载控制。
图4
图4。Mcl-1 3'UTR推测mir-29结合位点对荧光素酶表达的影响
面板a：mir-29b与源自Mcl-1 3'UTR的嵌件对齐。请注意mir-29b的5'端的互补性，关键种子区位于此处。如图所示，还合成了一个单碱基突变体插入物。插入物被克隆到p-Mir-Report载体的3'UTR中。b组：仅用荧光素酶构建物瞬时转染或与mir-29b（p29b）表达质粒共同转染的HeLa细胞中的荧光素酶活性。荧光素酶载体为亲本（pLuc）、带有Mcl-1衍生的3'UTR插入物的荧光素素酶（pLuc-Mcl-1 3'UTRs）或带有突变插入物的荧光素酶（p Luc-突变3'UTR-s）。平均值±SEM，*p<0.01。
图5
图5。转染mir-29b后对细胞凋亡的敏感性增加
a组：KMCH细胞转染50 nM下相同长度（反义）的前mir-29b RNA或对照RNA。22小时后，在新鲜培养基中以2 ng/mL的浓度添加TRAIL，并培养细胞4小时。然后用DAPI对细胞进行染色，并对凋亡细胞进行计数。平均值±扫描电镜，**p<0.001。b组：与a组相同，转染细胞并用TRAIL处理，但在4小时后测量caspase 3/7-like（DEVDase）活性。平均值±SEM，*p<0.01。
图6
图6。mir-29b拮抗剂对细胞凋亡的保护作用
a组：非恶性H69细胞和转染对照RNA前mir-29b或mir-29拮抗剂寡核苷酸LNA（各50nM）的恶性KMCH细胞分离的总蛋白的Western blot。小组b.如图5所示，对如上转染的H69和KMCH细胞进行凋亡形态学测量。注意，如先前的研究所述，H69细胞对TRAIL杀伤敏感，而除非转染mir-29b，否则KMCH细胞相对具有耐药性。与经溶媒处理的对照组相比，平均值±SEM，**p<0.0001；#与TRAIL治疗的mir-29相比，p<0.01；##与TRAIL治疗的mir-29相比，p<0.0001。c组：如上转染细胞的Caspase 3/7-like活性（DEVDase）。半胱氨酸天冬氨酸酶活性与形态学上的凋亡计数相平行。平均值±SEM，*p<0.01，与经溶媒处理的对照组相比**与车辆治疗对照组相比p<0.0001；##与TRAIL治疗的mir-29相比，p<0.0001。
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