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.2007年5月；101(4):1119-33.
doi:10.1111/j.1471-4159.2007.04486.x。 Epub 2007年3月29日。

RNA聚合酶II、C/EBPβ和NF-Y向大鼠GTP环水解酶I近端启动子的蛋白激酶A依赖性募集在组蛋白乙酰化没有改变的情况下发生

格雷戈里·卡帕托斯 1, Prashanthi Vunnava公司, 吴延宁
附属公司

RNA聚合酶II、C/EBPβ和NF-Y依赖于蛋白激酶A向大鼠GTP环水解酶I近端启动子募集，组蛋白乙酰化无变化

格雷戈里·卡帕托斯等。 神经化学杂志. 2007年5月.

摘要

使用近端启动子报告基因构建物和野生型或显性负蛋白的瞬时转染分析，研究了GTP环水解酶I（GCH1）基因转录对PC12细胞、蛋白激酶A缺陷的PC12细胞系126-1B2和C6细胞的环AMP刺激，染色质免疫沉淀和实时定量PCR。这些研究表明，蛋白激酶A对于cAMP调节元件和相邻的CCAAT盒所赋予的cAMP依赖性转录是必要和充分的。在完整的细胞中，这些顺式元件被证明与cAMP反应元件结合蛋白、CCAAT增强子结合蛋白β和核因子Y结合，每个蛋白控制cAMP响应的不同方面。Cyclic-AMP通过蛋白激酶A作用，刺激CCAAT增强子结合蛋白β、核因子Y和RNA聚合酶II的启动子募集，同时耗尽Cyclic-MAP反应元件结合蛋白的启动子。cAMP刺激转录与近端启动子核小体组蛋白H3和H4乙酰化增加无关，表明组蛋白乙酰转移酶不参与此反应。尽管如此，组蛋白去乙酰化酶活性的药理抑制确实增加了组蛋白H4乙酰化和RNA聚合酶II的募集，表明组蛋白乙酰转移酶通常与近端启动子相关。然而，只有在C6细胞中，组蛋白去乙酰化酶的抑制才能刺激转录并与cAMP协同作用。这些实验首次揭示了GCH1基因启动子在完整细胞内的功能，并为组蛋白乙酰转移酶复合物参与GCH1的基因转录提供了证据。

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数字

图1
图1
蛋白激酶A催化亚单位（PKAc）的过度表达模拟了cAMP对GCH1转录的细胞类型特异性作用。（a） 将PC12细胞与野生型GCH1启动子构建体p0.27rGCH-GL3、pRL-TK和5至100ng的pRC/RSV PKAc DNA（PKAc）共转染。约18小时后，裂解培养物并测定萤火虫和雷尼利亚使用双荧光素酶分析的荧光素酶活性。萤火虫活动标准化为雷尼利亚活性并表示为相对荧光素酶活性。（b） 大鼠的DNA序列一般合规H1CRE和CAT-box区域从−108到−77，并引入突变产生CREmt、CATmt和CREmtCATmt。（c） 用p0.27rGCH-GL3 WT、CREmt、CATmt或CREmtCATmt、pRL-TK转染PC12细胞，如发现25 ng pRC/RSV-PKAc。18小时后，将含有5 mmol/L 8Br-cAMP（cAMP）的条件培养基添加到未与PKAc共转染的孔中，4小时后收集所有细胞进行双核糖核酸酶分析。（d） C6细胞转染p0.27rGCH-GL3 WT、pRL-TK和25 ng的pRC/RSV-PKAc（PKAc）。18小时后，将含有5 mmol/L 8Br-cAMP（cAMP）的条件培养基添加到未与PKAc共转染的孔中，4小时后收集所有细胞进行双核糖核酸酶分析*第页与基础结构活性相比，≤0.05。
图2
图2
蛋白激酶A（PKA）对cAMP依赖性是必要的和充分的一般合规H1还涉及CREB、C/EBPβ和NF-Y的转录。（a）PKA-缺陷的126-1B2细胞与p0.27rGCH-GL3 WT、CREmt、CATmt或CREmtCATmt、pRL-TK以及25 ng的pRC/RSV-PKAc共同转染。18小时后，将含有5 mmol/L 8Br-cAMP（cAMP）的条件培养基添加到未与PKAc共转染的孔中，4小时后收集所有细胞进行双核糖核酸酶分析。（b） 提前18 h转染p0.27rGCH-GL3 WT和pRL-TK的PC12细胞与20μmol/L的H89、PKA抑制剂、30μmol/L的PD98059（PD）、MAPKK抑制剂、10μmol/L的SB203580（SB）、p38 MAPK抑制剂、100 nm的沃特曼（Wort）、PI3 K或DMSO抑制剂（载体）预培养30分钟0.1%，然后用5 mmol/L 8Br-cAMP（cAMP）处理4小时，然后采集用于分析。（c） 用p0.27rGCH-GL3 WT、pRL-TK和100 ng基于pRC/RSV的表达载体转染PC12细胞，这些表达载体编码野生型或显性阴性形式的CREB（A-CREB、CREB M1和CREB）、c/EBP（4H-CEBP和c/EBPβ）或ATF4（4H-ATF4和ATF4），然后用5 mmol/L 8Br-cAMP（cAMP）处理4 h，然后采集用于检测。（d） 用p0.27rGCH-GL3 WT、pRL-TK和编码野生型（NF-YA）或显性阴性（NF-YA m29）NF-YA的表达载体转染PC12细胞，然后用5 mmol/L 8Br-cAMP（cAMP）处理4 h，然后采集进行检测*第页与各自的控制活动相比，≤0.05。
图3
图3
蛋白激酶A依赖于PolII、C/EBPβ和NF-Y的募集，而不是CREB对一般合规H1近端启动子。（a） 对来自对照组和8Br-cAMP处理的PC12细胞的交联DNA进行超声处理，可重复产生平均大小为400 bp的片段。（b） 老鼠的示意图一般合规H15′侧翼区域显示PCR扩增的近端和远端启动子区域相对于转录起始点（+1）的位置。PC12 ChIP PCR反应的电泳一般合规H1近端和远端启动子引物对鉴定出大小正确的扩增子，并表明在基础条件下，Pol II、CREB、C/EBPβ和NF-Y与近端启动子相关，但与远端启动子无关。（c） PC12 ChIP样品的实时定量PCR分析一般合规H1近端启动子引物显示，在用5 mmol/L 8Br-cAMP（cAMP）孵育1小时后，Pol II、C/EBPβ和NF-Y（而非CREB）被招募到近端启动子中，PKA抑制剂H89（cAMP+H89）阻止了招募，而PKA抑制剂本身没有影响（H89）。（d） 126-1B2细胞ChIP样品的实时定量PCR分析一般合规H1近端启动子引物显示，Pol II、C/EBPβ和NF-Y在与5 mmol/L 8Br-cAMP（cAMP）孵育1h后未被招募到近端启动子中*第页与各自的控制活动相比，≤0.05。#第页与cAMP相比，≤0.05。
图4
图4
Pol II、C/EBPβ和NF-Y的募集不涉及组蛋白H3和H4在一般合规H1近端启动子平衡核小体。（a） 用10mmol/L丁酸钠（NaBut）、5mmol/L 8Br-cAMP（cAMP）、100 ng/mL曲古菌素a（TSA）或cAMP+TSA处理PC12细胞1h后等量酸溶性蛋白质的Western blot，并用针对K9、14二乙酰化H3（acH3）或K5、8、12、16四乙酰化H4（acH4）的抗体进行探测。（b） PC12-ChIP PCR反应的电泳一般合规H1近端和远端启动子引物对表明，在基础条件下，Pol II、acH3和acH4与近端启动子相关，但与远端启动子无关。类似分析使用c-fos公司近端启动子引物识别与Pol II、acH3和acH4 ChIP样本相关的正确大小的扩增子。（c） PC12 ChIP样品的实时定量PCR分析一般合规H1近端启动子引物。针对cAMP、TSA和cAMP+TSA，Pol II同样被招募。这些治疗都没有改变acH3的水平。相反，TSA和cAMP+TSA同样升高acH4水平。（d） PC12 ChIP样品的实时定量PCR分析c-fos公司近端启动子引物。Pol II是为了响应cAMP和TSA而招募的，但cAMP+TSA后Pol II的招募要大于单独治疗。这些治疗都没有改变acH3的水平。相反，cAMP、TSA和cAMP+TSA同样升高acH4水平。（e） C6-ChIP PCR反应的电泳一般合规H1近端和远端启动子引物对表明，在基础条件下，Pol II、acH3和acH4与近端启动子相关，但与远端启动子无关。（f） C6 ChIP样品的实时定量PCR分析一般合规H1近端启动子引物。Pol II不是针对cAMP招募的，而是在TSA和cAMP+TSA之后招募的。这些治疗都没有改变acH3的水平。相反，TSA和cAMP+TSA都会升高acH4水平*第页与相应的对照活性相比≤0.05。#第页与cAMP或TSA单独比较时≤0.05。
图5
图5
组蛋白去乙酰化酶活性的抑制增加C6细胞中GCH1 mRNA水平，但不增加PC12细胞。（a） 实时逆转录定量PCR分析一般合规H1PC12细胞、126-1B2或C6细胞中的mRNA与5 mmol/L 8Br-cAMP（cAMP）、100 ng/mL曲古抑菌素A（TSA）或cAMP+TSA孵育4 h。（b） 实时逆转录定量PCR分析c-fos公司PC12或C6细胞中的mRNA与5 mmol/L 8Br-cAMP（cAMP）、100 ng/mL曲古菌素A（TSA）或cAMP+TSA孵育4 h*第页与各自的控制活动相比，≤0.05。#第页与cAMP或TSA单独比较时≤0.05。
图6
图6
cAMP依赖模型一般合规H1转录。早期cAMP反应。早期cAMP反应描述了cAMP依赖性转录的机制，该机制由CREB和NF-Y通过CRE和CCAAT-box介导。为了响应cAMP细胞质水平的增加，PKA被激活，PKAc被转运到细胞核。已经与CRE结合的CREB在关键调控位点Ser133被PKAc磷酸化，导致共激活物CBP向启动子募集。CBP与全酶复合物相互作用，使Pol II和一般转录机制与启动子接触。作为响应，Pol II的CTD在丝氨酸5处被Cdk7（TFIIH的一种成分）磷酸化，生成预引发复合物。PKAc对NF-Y的磷酸化促进NF-Y与CCAAT-盒的结合以及NF-Y招募共激活物RNF4。通过与NF-Y和TBP的相互作用，RNF4增强了TBP与弱者的结合一般合规H1TATA盒，因此与美国海关与边境保护局（CBP）一起用于连接转录机器。随后，在丝氨酸2处的Pol II CTD被未知激酶磷酸化后，转录延伸继续进行。晚期cAMP反应：晚期cAMP-反应描述了通过向CRE募集C/EBPβ终止cAMP依赖性转录的机制。C/EBPβ在细胞质中被PKAc磷酸化，然后穿梭到细胞核。当进入细胞核时，磷酸化C/EBPβ从CRE中取代CREB，从启动子中取代协同激活剂CBP。NF-Y和RNF4也从CCAAT盒中移出。启动子缺失CREB、NF-Y和相关共激活物后，释放全酶复合物，转录减弱。
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