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.2007年4月；117(4):889-901.
doi:10.1172/JCI30556。 Epub 2007年3月22日。

巨噬细胞和肌纤维中IKK/NF-kappaB信号的相互作用促进Duchenne型肌营养不良症患者的肌肉退化

斯瓦纳利·阿查里亚 1, S阿曼多·维拉尔塔, 纳丁·巴卡尔, Tepmanas Bupha-Intr公司, 保罗·M·L·詹森, 迈克尔·卡拉瑟斯, 李志伟, Amer A Beg公司, 桑卡·戈什, 扎里夫·萨亨克, 温斯坦, 凯瑟琳·加德纳, 吉尔·A·拉斐尔·福特尼, 迈克尔·卡林, 詹姆斯·G·潮球, 阿尔伯特·S·鲍德温, 丹尼斯·古特里奇
附属公司

巨噬细胞和肌纤维中IKK/NF-kappaB信号的相互作用促进Duchenne型肌营养不良症患者的肌肉退化

斯瓦纳利·阿查里亚等人。 临床研究杂志. 2007年4月.

摘要

杜氏肌营养不良症（DMD）是一种致命的X连锁疾病，与肌营养不良蛋白缺乏症相关，可导致慢性炎症和严重的骨骼肌退化。在DMD小鼠模型和患者中，我们发现免疫细胞和再生肌纤维中的IkapaB激酶/NF-kappaB（IKK/NF-kapbaB）信号持续升高。消融NF-kappaB p65亚单位的1个等位基因足以改善DMD模型mdx小鼠的病理学。此外，mdx小鼠中IKKbeta的条件性缺失表明，NF-kappaB在活化的巨噬细胞中发挥作用，促进炎症和肌肉坏死，在骨骼肌纤维中通过抑制肌肉祖细胞限制再生。此外，IKK的特异性药理抑制可改善mdx小鼠的病理和肌肉功能。总之，这些结果强调了NF-kappaB在肌营养不良进展中的关键作用，并提示IKK/NF-kappaB信号通路是DMD的潜在治疗靶点。

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数字

图1
图1。营养不良肌肉中的NF-κB活性局限于肌肉和免疫细胞。
(A类–C)肌肉细胞核提取物5周龄WT C57BL/10和3周龄和5周龄中密度纤维板老鼠(A类)，5周龄WT和中密度纤维板老鼠(B类)，或7周龄WT，mdx、，和DKO小鼠(C)κB和Oct-1。对中密度纤维板肌肉提取物使用抗p65和p50的抗体。箭头表示移位的子单元。(D类)用IκBα进行IKK分析WT和突变体（双丝氨酸到苏氨酸[SS/TT]）或p65 WT和突变（丝氨酸到丙氨酸[S/A]）底物使用来自7周龄WT或中密度纤维板老鼠。检测免疫沉淀物用于IKKγ作为加载控制。显示的蛋白质斑点p-IKK、p-IκBα、IκBα、p-p65、，和第65页。GST、谷胱甘肽-S公司-转移酶。(E类)7周龄WT或中密度纤维板老鼠是p-p65免疫染色。比例尺：50μm。黑色箭头表示免疫细胞，蓝色箭头表示再生纤维。(F类)4周龄或7周龄的肌肉中密度纤维板小鼠用p-p65（绿色）和CD68双重染色（红色）或p-p65和E-MyHC（红色）。比例尺：20微米。(G公司)H&E染色和p-p65对健康对照组的肌肉活检进行免疫组化和年龄匹配的DMD患者(n个= 4). 比例尺：50微米。
图2
图2。NF-κB活性在婴儿出生后发育过程中被解除调控中密度纤维板老鼠。
(A类)5周龄野生动物肌肉提取物；3xκB-Luc-Tg或mdx；制备3xκB-Luc-Tg小鼠用于荧光素酶分析。荧光素酶值归一化为总蛋白。*P（P）< 0.05;n个= 5.(B类)对腓肠肌进行荧光素酶免疫染色7周龄WT表达；3xκB-Luc-Tg和mdx；3xκB-Luc-Tg小鼠(n个= 3).比例尺：50μm。(C)NF-κB的EMSA和Oct-1在来自WT和中密度纤维板小鼠出生后发育期间。(D类)从6日龄WT中分离出的原代成肌细胞；3xκ-Luc-Tg和中密度纤维板;3xκB-Luc-Tg小鼠分化然后切换到单独的介质或包含TNF-α（5 ng/ml）6小时。
图3
图3。p65杂合性缺失拯救中密度纤维板病理学。
(A类)肌肉冷冻切片的组织病理学染色H&E，比较5周龄中密度纤维板;第65页+/+和mdx；第65页+/–老鼠或mdx；第50页+/+和mdx；第50页+/–老鼠。比例尺：20微米。(B类)WT C57BL/10的腓肠肌切片，mdx；第65页+/+，以及中密度纤维板;第65页+/–用F4/80对小鼠进行免疫染色。比例尺：50μm。(C)从肌肉的剩余部分分离出RNA对溶菌酶和CD68进行实时PCR，比较5周龄的WTC57BL/10，mdx；第65页+/+，以及mdx；第65页+/–老鼠(n个= 3). (D类)坏死纤维来自根据IgG染色定量腓肠肌（填充纤维以红色显示，细胞核以蓝色显示）(n个= 5). 比例尺：100μm。(E类)钙化的定量来自mdx；第65页+/+和中密度纤维板;第65页+/–肌肉(n个= 10). 数据绘制为平均值±来自2个独立实验的SEM*P（P）< 0.05.
图4
图4。p65杂合缺失促进再生肌生成中密度纤维板老鼠。
(A类)7周龄腓肠肌冷冻切片mdx；第65页+/+和mdx；第65页+/–雄性小鼠H&E染色（顶行）或E-MyHC免疫染色（底行行）。比例尺：15μm（顶部）和50μm（底部）。(B类和C)定量E-MyHC–阳性纤维和CLN。(D类和E类)5周龄心脏毒物治疗后的TA切片第65页+/+和第65页+/–小鼠被染色计算了H&E和E-MyHC纤维的数量。比例尺：20微米。数据绘制为2的平均值±SEM独立实验(n个= 4). *P（P）< 0.05.
图5
图5。髓系细胞中IKKβ缺失可减轻炎症。
(A类和B类)4周龄的腓肠肌切片mdx；伊克β前/后和mdx；伊克β飞行/飞行；赖氨酸Cre男性的通过双重免疫荧光染色对小鼠进行分析IKKβ（绿色）和CD68（红色）(A类)或通过p-p65的免疫组织化学研究(B类). 中的虚线白线A类标记巨噬细胞区域。m、 肌肉纤维。比例尺：10微米。(B类)p-p65免疫组化染色免疫浸润（顶行）和再生肌纤维（底行）。比例尺：15μm（顶部）和10μm（底部）。(C)通过IgG染色鉴定坏死纤维（填充纤维为红色，细胞核为蓝色）(n个= 6). 比例尺：50微米。坏死的量化显示在图表中。(D类)性别和性别TA中CD68的实时PCR分析年龄匹配的WT，mdx；伊克β前/后和mdx；伊克βF/F；Lys-Cre公司老鼠。(E类)实时PCR分析如D类TNF-α、IL-1β和MCP-1。图表绘制为平均值±SEM*P（P）<0.05.
图6
图6。肌肉细胞中IKKβ缺失促进再生。
4周后收获的肌肉(A类–F类)或12周龄(F类仅限）mdx；伊克β前/后和mdx；伊克β飞行/飞行；MLC-Cre公司老鼠用于蛋白质分析(A类和C)或组织学(B类和D类). (A类)西部检测IKK亚单位的杂交。(B类)肌肉免疫染色用于p-p65表达。(C)检测p-p65、p65、，和IκBα。(D类)H&E染色属于mdx；伊克β前/后和mdx；伊克β飞行/飞行；MLC-Cre公司肌肉。(E类)肌肉用于D类被染色的原因E-MyHC阳性染色纤维的定量或CLN计数的H&E*P（P）< 0.05.比例尺：15μm(B类)和50微米(D类). 图表绘制为平均值±SEM。(F类)平均纤维分布mdx；伊克β前/后和mdx；伊克β飞行/飞行；MLC-Cre公司老鼠从随机选择的场中至少3000根纤维中测定，从每组至少4只小鼠的多个肌肉切片中获得。
图7
图7。缺乏IKKβ的小鼠的肌祖细胞增加。
从4周龄时采集腓肠肌或股四头肌mdx；伊克β前/后和mdx；伊克β飞行/飞行；MLC-Cre公司老鼠并冷冻用于RNA分析(A类)，冷冻切片(B类)或均质用于免疫印迹(C).(A类)CD68、TNF-α，IL-1β、MCP-1、RANTES和MIP-1α（巨噬细胞炎症蛋白1α）组。(B类)章节如所述A类或来自7周龄mdx；第65页+/+和mdx；第65页+/–老鼠是用MyoD进行免疫染色，并从随机选择的至少20个样本中进行定量每组3-4只动物，每节田地。(C)免疫印迹法检测Pax7和α-微管蛋白。(D类和E类)从混合的后肢分离卫星细胞4周龄婴儿的肌肉mdx；伊克β前/后和mdx；伊克β飞行/飞行；MLC Cre公司同窝卵，固定并用Pax7染色或分化为3天，然后用MyHC染色以确定肌管数量标准化每毫米2区域。比例尺：200μm。(F类)新鲜分离细胞的流式细胞仪分析4周龄mdx；伊克β前/后和mdx；伊克β飞行/飞行；MLC-Cre公司老鼠用细胞表面标记物CD34和Sca-1染色。图形表示两个独立实验的平均值。数据绘制为平均值±扫描电镜。
图8
图8。IKK的药理学抑制挽救了营养不良肌肉的组织病理学和功能。
(A类)WT或突变（mut）NBD肽的氨基酸序列。带下划线的氨基酸表示从野生型到突变型的变化。(B类)WT或突变NBD的比目鱼肌-治疗用F4/80对小鼠进行染色，并对巨噬细胞进行定量。比例尺：300微米。(C)腓肠肌中密度纤维板对治疗4周的小鼠进行切片和染色带有p-p65(C)或H&E(E类).比例尺：20μm(C和E类).(D类)小鼠的裂解液用于免疫印迹检测p-p65、p65和IκBα。(F类)RNA是与用于D类包括C57BL/10和中密度纤维板对照组，进行实时PCR溶菌酶(n个= 4). (G公司)再生电位通过对具有中心成核和阳性的纤维进行定量来测量E-MyHC染色中密度纤维板用生理盐水或NBD处理的小鼠肽。(H（H）)通过测量主动力评估产生的力两种WT治疗小鼠膈肌的发育力比较或突变NBD肽4周。定量数据绘制为平均值±3个独立实验的SEM*P（P）< 0.05.
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