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.2007年5月11日；282(19):14262-71.
doi:10.1074/jbc。M60990020。 Epub 2007年3月16日。

酿酒酵母组蛋白去甲基化酶的鉴定

胜江图 1, 埃丝特·M·布洛赫, 杨兰浩, 陈仁, 黄伟杰, 庞洪旭, Chein-Hung Chen先生, 廖忠林, 惠明玉, 罗万胜, 迈克尔·弗雷塔斯, 蔡明道
附属机构

酿酒酵母组蛋白去甲基化酶的鉴定

胜江图等。 生物化学杂志. .

摘要

基于组蛋白赖氨酸脱甲基酶可能包含JmjC结构域的预测，我们检测了酿酒酵母的五个敲除菌株（ecm5Delta、gis1Delta、rph1Delta、jhd1Delta和jhd2Delta（yjr119cDelta））的甲基化模式。组蛋白H3的质谱（MS）分析显示，除ecm5Delta外，所有突变体的修饰都增加。高分辨率MS用于明确区分各种胰蛋白酶片段中的三甲基化和乙酰化。特异片段的相对丰度表明组蛋白K36me3和K4me3分别在rph1Delta和jhd2Delta株中积累，而组蛋白K365me2和K36me在gis1Delta和jhd1Delta株都积累。对过度表达JmjC蛋白的菌株进行的分析产生了甲基化模式的变化，与互补敲除菌株的甲基化模式相反。体外酶活性测定证实，Rph1的JmjC结构域主要特异性地去甲基化K36me3，其次是K36me2。RPH1的过度表达在紫外线照射下产生生长缺陷。Rph1的脱甲基酶活性与表型有关。总的来说，除了Jhd1之外，我们的结果还鉴定了三种新的含JmjC结构域的组蛋白脱甲基酶及其在酿酒酵母芽殖中的作用位点。此外，这里描述的方法将有助于识别组蛋白去甲基化酶及其在其他生物体中的靶位点。

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数字

图1
图1。五种JmjC结构域蛋白酿酒酵母
A类，域结构。这些图表来自SMART数据库。每个蛋白质名称后面都跟有基因的开放阅读框名称。采埃孚表示锌指结构域。B类，核心β-五种酵母JmjC蛋白的片状序列比对。预测β-板材序列用字母表示b并以突出显示粗体斜体字母.预测的协同因子Fe2+结合位点如所示红色和预测α-酮戊二酸结合位点蓝色.
图2
图2。JmjC基因敲除株组蛋白H3甲基化的整体变化
A类WT H3的典型LC-MS光谱。最高峰有六个甲基化当量。B、，条形图显示敲除菌株中每个峰值相对于WT的“相对百分比变化”。对于给定的峰值(我)，使用以下方程式计算相对百分比变化：100×[percentage（突变体，我)−百分比（WT，我)]/百分比（重量，我).
图3
图3。敲除菌株组蛋白H3甲基化的位点特异性定量
未修饰、单甲基、二甲基和三甲基肽的相对水平以百分比表示面板A,B类、和C类分别表示H3-K4、-K36和-K79。*，第页<0.05; #,第页<0.1.
图4
图4。过表达菌株的MS分析
A类，条形图显示了过表达菌株中每个峰值相对于WT的“相对百分比变化”。B类，野生型和过表达菌株的全长组蛋白H3-MS光谱RPH1型和金华二期C，截短H3（残基22–135）的相应光谱。
图5
图5。过表达菌株组蛋白H3甲基化的位点特异性定量
H3-K4、-K36和-K79肽的定量显示在A类,B类、和C类分别为，*，第页<0.05; #,第页<0.1.
图6
图6。体外GST-Rph1-（1-373）的酶分析
A类，关于K36me2肽去甲基化的MALDI-TOF MS数据。B、，K36me3肽去甲基化的MS数据。C、，控制实验。固体和开放式列分别表示K36me3和K36me2肽的转化率。列数：1，正常分析；2，不含酶的对照分析；三，无对照分析α-酮戊二酸(α-千克);4，不含铁的对照分析2+;5，EDTA过量的对照分析；6，用Rph1 H235A突变体进行测定。
图7
图7。组蛋白去甲基化酶基因过表达酵母的生长表型
A类，过度表达RPH1型在合成培养基中，SC-乌拉西尔有生长缺陷。细胞在棉籽糖中生长到A类600将达到1.0的溶液稀释10倍，并用2%葡萄糖在SC尿嘧啶板上斑点(左侧面板)或半乳糖(右侧面板).B类，RPH1过表达菌株对紫外线照射的超敏反应。细胞在含有2%葡萄糖的富培养基（YP）中生长(DEX公司)或半乳糖(女孩). 通过在YP-半乳糖平板上连续稀释细胞，然后暴露于紫外线照射（10 mJ/cm2).C类Rph1组蛋白去甲基化酶活性与细胞对DNA损伤的存活有关。这个转速1缺失菌株(转速1Δ）用不含插入物的质粒转化(矢量)或镀锌1启动子驱动的野生型(RPH1型)和活性缺陷突变体(转速1H235A型)分别是。按照中所述进行紫外线敏感性分析B类.
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