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.2007年4月10日；46(14):4322-36.
doi:10.1021/bi062140c。 Epub 2007年3月17日。

C2结构域特异性膜靶向机制：靶脂局部池增强Ca2+亲和力

约翰·科尔宾 1, 约翰·埃文斯, 凯尔·E·兰德格拉夫, 约瑟夫·J·福尔克
附属公司

C2结构域特异性膜靶向机制：靶脂局部池增强Ca2+亲和力

约翰·科尔宾等人。 生物化学. .

摘要

C2结构域是一种普遍存在的保守蛋白信号基序，广泛存在于真核细胞信号蛋白中。虽然存在相当大的功能多样性，但大多数C2结构域都被Ca2+结合激活，然后与特定的细胞膜对接。例如，已知蛋白激酶Calpha（PKCα）和胞质磷脂酶A2α（cPLA2α）的C2结构域在细胞内Ca2+信号期间与不同的膜表面对接。Ca2+激活靶向质膜的PKCalpha C2结构域和内膜的cPLA2alpha C2区域，没有可检测到的空间重叠。在典型的信号事件中，生理体积Ca2+浓度很少超过1μM，因此确定如何实现这种靶向特异性至关重要。对于存在生理钙水平的分离的PKCalpha C2结构域，靶脂质磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）的结合足以将PKCalphaC2结构域补充到模拟质膜内叶的脂质混合物中。对于cPLA2alpha C2结构域，靶脂磷脂酰胆碱（PC）似乎足以在生理Ca2+水平上驱动膜靶向内膜模拟物，尽管结果并不排除第二个未知靶分子。停流动力学研究提供了有关Ca2+激活的膜对接过程中发生的基本分子事件的额外信息。原则上，C2域定向细胞内靶向需要同时检测多个信号（Ca2+和一个或多个靶脂质），可以表现出两种不同的机制：信使激活的靶亲和力（MATA）和靶激活的信使亲和力（TAMA）。这里研究的C2结构域均利用TAMA机制，其中C2结构域Ca2+亲和力太低，无法被细胞大多数区域的生理Ca2+信号激活。只有当C2结构域接近其靶膜（提供高局部浓度的靶脂）时，有效的Ca2+亲和力才能通过耦合结合平衡增加到能够实现大量Ca2+活化和靶对接的水平。总的来说，研究结果强调了在靶向研究中使用生理配体浓度的重要性，因为即使在缺少重要靶向分子的情况下，超生理浓度也可以驱动对接相互作用。

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图1
图1
共表达和Ca2+-激活靶向PKCα和cPLA2-巨噬细胞衍生细胞系中的C2结构域。图示为PKCα-和cPLA的（A和B）黄色和（C和D）红色荧光蛋白融合2-C2结构域分别在同一RAW264.7细胞中共存。时间零点（A和C）的图像显示了在添加离子霉素之前两种荧光蛋白在细胞质和细胞核中的分布，离子霉素触发了全局Ca2+信号。在添加后的9秒内，（B）PKCαC2结构域从细胞质募集到质膜，（D）cPLA2C2结构域从细胞质和核室招募到核、高尔基体和内质网膜。后两幅图像（E）的叠加显示了这两个C2域分别对血浆和内膜的唯一、非重叠靶向。为了简单起见，显示的图像是穿过细胞的中间平面切片。这样的中平面图像没有显示在质膜顶面和底面观察到的PKCα-C2结构域募集荧光的点状模式（27）。此外，这些瞬时转染没有表现出在类似条件下对稳定转染的RAW细胞观察到的细胞极化（Evans，J.H.和Falke，J.J.，未发表的工作）。
图2
图2
PKCα-和cPLA的平衡结合2磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酰乙醇胺（PE）的简单脂质混合物的α-C2结构域。所示为Ca2+钙的滴定曲线2+-（A）PKCα-C2和（B）cPLA的触发对接2α-C2到声波作用的单层小泡，由简单的脂质混合物组成，粗略地类似于质膜（PE/PC/PS/dPE，65/10/20/5 mol%）或内膜（PE/PC/PS/dPE，40/50/5/5 mol%）的内叶。观察到PKCα-C2结构域更喜欢含有20 mol%PS的简单质膜模拟物，而不是含有5 mol%PS的内膜模拟物2与含有10 mol%PC的简单质膜模拟物相比，α-C2结构域对含有50 mol%PC的简单内膜模拟物表现出较弱的偏好性。然而，这两种C2结构域-膜组合都未能在Ca的生理范围内产生实质性的膜对接2+在细胞质中观察到的浓度（黑条）。通过测量蛋白质中天然Trp供体和膜中低水平的丹酰化磷脂酰乙醇胺（dPE）受体之间的蛋白-膜FRET来量化膜对接。实心曲线表示与希尔方程（等式1）的最佳拟合。在每个框中，上曲线被归一化，以便其渐近接近统一，而其他曲线则绘制在相同的相对荧光标度上，强调它们在饱和[Ca2+]。
图3
图3
PKCα和cPLA的平衡结合2生理脂质混合物的α-C2结构域。所示为Ca2+钙的滴定曲线2+-（A）PKCα-C2和（B）cPLA的触发对接2α-C2到声波作用的单层囊泡，由复杂的生理性脂质混合物组成，其中含有磷脂酰乙醇胺（PE）、胆固醇（CH）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂肌醇（PI）、鞘磷脂（SM）和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP）2). 标记为PM[2%PIP的膜2]和PM[6%PIP2]模拟质膜内叶（PE/CH/PS/PC/dPE/PI/SM/PIP2，摩尔百分比（27.5或23.5）/25/21/10.5/5/4.5/4.5/（2或6），而标记IM的膜模拟了内膜（PC/PE/CH/dPE/PS/PI/SM，摩尔百分比49.5/27/5/5/4.5/4.5/4.5）。其他膜是通过对这两种基本混合物进行改性而形成的，以测试单个组分的重要性，得到表1中总结的组分。（A） PKCαC2结构域对质膜模拟物PM表现出高度特异性[2%PIP2]和PM[6%PIP2]并在生理钙水平被这些膜有效吸收2+浓度（黑色条）。相反，内膜模拟IM和缺乏PS、PIP的膜2或这两种靶脂质都未能在生理钙中募集到C2结构域2+浓度。（B） 中国解放军2与质膜模拟物（PM-[6%PIP）相比，α-C2结构域对内膜模拟物的特异性较弱2])并且在生理Ca下被膜吸收不良2+浓度（黑色条）。去除靶脂PC（IM（−）PC）显著降低了该C2结构域对膜的亲和力。如图2图例所示，通过蛋白质-膜FRET定量蛋白质与膜的对接。实心曲线表示与希尔方程（等式1）的最佳拟合，得出[Ca2+]1/2表2中总结的值和Hill系数。在每个框中，上曲线被归一化，以便其渐近接近统一，而其他曲线则绘制在相同的相对荧光标度上，以突出饱和[Ca时蛋白质-膜FRET的不同平衡水平2+]。
图4
图4
膜浓度对[Ca的影响2+]1/2Ca值2+-PKCα和cPLA的触发对接2α-C2结构域。显示的是[Ca2+]1/2C2结构域与由生理性脂质混合物组成的声波单层囊泡对接的值。（A） [加利福尼亚州2+]1/2PKCα-C2与质膜内叶生理模拟物对接的值（表1，PM[2%PIP2])在不同可获得的脂质浓度下。观察到的[Ca2+]1/2该值与所检查范围内的脂质浓度无关，接近预期的微摩尔生理钙阈值2+信号（---）。（B） [加利福尼亚州2+]1/2cPLA对接值2α-C2与不同可获得脂质浓度下的内膜生理模拟（表1，IM）。观察到的[Ca2+]1/2该值强烈依赖于可达到范围内的脂质浓度。假设所示的线性或渐近外推（•••），[Ca2+]1/2总脂浓度在700到1000之间时，该值将下降到生理微摩尔范围μM易得脂质。可接近的脂质浓度计算为总脂质浓度的一半，假设大约一半的脂质暴露在囊泡的外叶上。[加利福尼亚州]2+]1/2通过测量Ca期间蛋白质与膜的对接来确定值2+滴定如图2和图3所示。
图5
图5
不同钙浓度下PKCα-C2结构域与生理性脂质混合物对接的动力学分析2+浓度。（A） 1 mM或5 mM膜快速混合引发的缔合反应μM钙2+和停流荧光计中的C2域。在1 mM Ca下观察到的缔合动力学2+不同的质膜（PM[2%PIP2])并检测内膜（IM）模拟物。相比之下，观察到的质膜模拟物（PM[2%PIP2])在5μM钙2+除了与其他反应相同的快速组分外，还显示出明显较慢的第二组分。（B） 蛋白质-钙快速混合引发的解离反应2+-EDTA膜复合物。与质膜模拟物（PM[2%PIP）的分离2])比从内膜模拟物（IM）分离慢5倍。减少钙2+浓度从1 mM到5μM几乎没有效果。数据点下的固体曲线表示单指数或双指数过程的最佳拟合，得出表4中总结的表观速率常数。通过蛋白质-膜FRET测量定量了膜的结合（图2的图例）。
图6
图6
cPLA的动力学分析2不同钙浓度下α-C2结构域与生理脂质混合物的对接2+浓度。（A） 1 mM或5 mM膜快速混合引发的缔合反应μM钙2+和停流荧光计中的C2域。在1 mM Ca下观察到的缔合动力学2+不同的内膜（IM）和质膜（PM）模拟物的检测结果相似，但当钙浓度增加时，动力学变慢2+减至5μM，因为游离Ca的浓度降低2+-在对接反应中加载C2域（见正文）。（B） 蛋白质-钙的快速混合引发的解离反应2+-EDTA膜复合物。从内膜模拟物（IM）的分离速度比从质膜模拟物的分离速度慢3倍（PM[6%PIP2]). 减少钙2+浓度从1 mM到5μM几乎没有效果。所示的膜模拟物缩写对应于表1和表4中的以下脂质成分：PM，PM[6%PIP2]; 即时消息，即时消息；IM（−）PC，IM[13.5%PC]。数据点下的固体曲线表示单指数或双指数过程的最佳拟合，得出表4中总结的表观速率常数。通过蛋白质-膜FRET测量定量了膜的结合（图2的图例）。
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参考文献

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