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比较研究
.2007年3月14日；27(11):3017-29.
doi:10.1523/JNEUROSCI.4037-06.2007。

脑源性神经营养因子促进成人海马长期增强相关细胞骨架变化

克里斯托弗·雷克斯 1, 林静宜, 埃尼科·克拉马尔, 露露·Y·陈, 克里斯汀·加尔, 林奇
附属公司
比较研究

脑源性神经营养因子促进成人海马长期增强相关细胞骨架变化

克里斯托弗·雷克斯等。 神经科学. .

摘要

脑源性神经营养因子（BDNF）是一种极为有效的阳性调节剂，可调节成年海马的θ突发诱导的长期增强（LTP）。目前的研究测试了神经营养素是否通过促进树突棘的细胞骨架变化而发挥其作用。当BDNF单独应用于大鼠海马脑片时，其对丝状肌动蛋白（F-actin）的指骨样蛋白标记没有改变，但显著增加了θ突发刺激阈值水平产生的密集标记棘的数量。相反，BDNF清除剂TrkB-Fc完全阻断了θ刺激阈上水平产生的脊椎F-actin的增加。当在θ训练后施用1-2分钟，但不是10分钟时，TrkB-Fc也阻断LTP巩固。另外的实验证实，p21活化激酶和cofilin这两种与脊柱形态发生有关的肌动蛋白调节蛋白集中在成熟海马的脊柱中，并进一步表明，在输注BDNF后，这两种蛋白都会经历快速的、剂量依赖性的磷酸化。这些结果表明，BDNF对肌动蛋白细胞骨架的影响保留到成年期，在成年期BDNF有助于积极调节时间依赖性LTP巩固过程。

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数字

图1。
图1。
Theta爆发刺激增加成年树突状棘的F-actin标记。A类，在接受局部罗丹明-鬼臼苷后再进行低频刺激（LFS，顶部）或LTP诱导TBS（底部）的海马脑片CA1区F-actin标记的低倍显微照片。比例尺，10μm。B类，用罗丹明-指骨苷标记的树突棘的高放大图像。i–iiiθ波刺激后显示典型的标记：经常观察到脊椎头部沿着标记较弱的树突突起聚集(我,三)但也是孤立发生的(ii（ii）,三).iv（四）显示了仅接受低频刺激的切片中的典型标记。比例尺，2μm。C–H型根据激光扫描共聚焦显微镜的评估结果，使用PSD-95-IR对罗丹明-指骨苷进行定殖。C–E类,现场卵磷脂标记(C)，PSD-95免疫染色(天)和二者的叠加(E类)TBS切片中CA1放射状街道的一个区域。结肠镜检有两种形式：一种是在F-肌动蛋白阳性脊柱尖端的PSD-95免疫活性帽（箭头位于E类)或两个标签的重叠（参见中的箭头C–E类).F–H（飞行高度）在中显示箭头周围的区域E类放大倍率较高时（箭头指示相同的位置E–H（E–H）)以说明PSD-95封顶效果。比例尺：（英寸C)C,天，5微米；（英寸F类)F–H（飞行高度），2微米。
图2。
图2。
脊柱检测分析程序就地罗丹明-阴茎肽标记。面板说明了代表性鬼笔肽标记领域的脊柱检测分析技术。在实验治疗（罗丹明-指骨肽输注、刺激）后，将切片固定并在20μm处切片，以评估树突棘标记。A类，对于所分析的每一部分，定期、连续地收集一系列宽视野显微照片z（z）-轴平面(i–iv)使用扩展焦距成像进行塌陷(v（v）)消除离焦噪声，通过z（z）-切片的轴。比例尺：（英寸我)i–v型，10微米。B类、代表性显微照片(我)显示已折叠Z-仅对切片进行低频刺激的序列图像。对于脊椎分析，图像像素强度被反转，以使罗丹明标记的元素显示为暗点。ii–iv显示三个像素强度阈值级别的脊椎检测软件输出（阈值从ii–iv)：随着强度阈值的降低，分析软件识别出更多的脊椎。注意，标记强烈的脊椎（例如箭头处的脊椎Bi公司)在所有阈值水平上都可以检测到，并用对象编号进行识别，而只有当强度过滤器设置得很低时，才会检测到模糊标记的脊椎（箭头）(iv（四）). 比例尺：（in我),i–iv，10微米。C，条形图显示550μm范围内强标记棘状点状物的组平均值±SEM计数2海马切片的样本区域在TBS（−20′）前20分钟或TBS后0.5、20或60分钟开始注入罗丹明-指骨苷20分钟（仅在高阈值下检测到脊椎，145个PIU水平）。各组间标记脊柱计数无显著差异(第页>0.7，单向方差分析）。
图3。
图3。
TBS诱导的F-actin标记受到NMDA受体拮抗剂的空间限制和阻断。A类,B类，罗丹明-指骨苷标记的成年海马切片中放射状CA1条的低倍显微照片就地.中间有明亮的标签A类标记刺激电极（切片表面以下40–60μm）在放射状链中远部的位置。与刺激电极的近端位置对齐的叶片轮廓（虚线之间）如下所示B类.比例尺：（inB类)A类,B类，10微米。C，刺激区（中部）和邻近近端（顶部）和远端（底部）区域的扩大B类结果表明，强健的脊柱标记仅限于含有受刺激传入纤维的椎板。比例尺，10μm。天，接受TBS切片的海马区CA1的显微照片；刺激电极的位置用白色圆圈表示。E类，空间频率图绘制了海马区10×10μm采样区内强烈标记的脊柱数量（>145 PIU）的分布，如图所示天强烈标记的脊椎频率由灰度强度表示。灰度校准条（右侧）显示由不同灰度表示的每个采样区域的脊椎数。F类,G公司，在单独存在aCSF（TBS）或与100μ米APV（TBS+APV）。比例尺，10μm。H（H）顶图描述了550μm范围内标签像素强度的整个范围内脊椎计数的累积分数2对照非模拟切片（aCSF，虚线）与APV处理切片（实线）的采样区。下图绘制了aCSF中用TBS刺激的切片（虚线）与在APV存在下接受TBS的切片（实线）相比的相同分布。
图4。
图4。
latrunculin A逆转了TBS诱导的密标棘数量增加。A–C，左侧，550μm的显微照片2使用低强度照明采集的采样区域，来自就地接受基线刺激（CON）、TBS或存在500 n TBS的卵磷脂标记切片米latrunculin A（LAT-A）。请注意，TBS导致含有F-actin的密集类生殖器蛋白标记的结构显著增加，并且这种影响被latrunculin a消除。这三个部分的标记密度伪彩色表示（底部的PIU校准）如右图所示(ii（ii）和三在里面A–C). 控件(艾伊)有许多轻度标记（光谱蓝色端）的点状物，在较高放大倍数下（插图，Aiii公司)，可以看到是脊椎。带有增强突触的TBS切片(Bii公司,比尔)有许多绿色到黄色的斑点，表明标记密集；latrunculin A处理的切片中没有这些轮廓(Cii公司,Ciii公司)也收到TBS。比例尺：（inA类)Ai–Ci、Aii–Cii，10微米；Aiii–Ciii，5微米。天，Plot描述了脊柱频率（表示为标记脊柱总数的累积分数），作为接受基线/对照刺激（CON，蓝色虚线）、TBS（红色实线）或TBS（500 n）时各组切片的平均脊柱标记强度的函数米latrunculin A（绿色实线）。与对照组相比，经TBS处理的切片的强度分布明显转向高强度标记（K–S检验，天= 0.25;第页<0.0001），而latrunculin A处理的切片几乎没有显示强烈标记的脊椎（K–S测试与对照，天= 0.10;第页< 0.01).E类，条形图绘制了独立实验中可识别棘总数（标记强度≥75 PIU）的组平均值±SEM值，这些实验有助于绘制天：标记的脊椎总数在各治疗组之间没有差异(第页>0.7，单向方差分析）。F类，图中显示了来自独立实验的组平均值±SEM值（标记强度≥145个PIU），这些实验产生了天：数值表明，TBS前输注latrunculin A可消除TBS通常产生的强标记棘的存在(**第页<0.01，双尾t吨试验组与对照组）。G公司，图表显示了从对照切片（aCSF，开圆）或接受500n浴敷的切片记录的fEPSP斜率米在TBS（箭头）之前20分钟开始，持续30分钟。在latrunculin A处理的切片中，与aCSF对照组相比，TBS后2小时LTP显著降低(第页<0.01，双向重复测量100–120分钟的方差分析）。
图5。
图5。
BDNF降低TBS诱导的脊椎F-actin增加的阈值。用罗丹明-指骨苷处理海马切片20分钟，然后收集基线反应，然后应用TBS。A类，罗丹明-指骨苷标记的照片显示，单独使用时（左），两次θ波并没有增加密集标记棘的数量，但在存在2n的情况下使用时会增加米BDNF（右）。比例尺，10μm。B类组数据（平均值±SEM）证实，仅接受两次θ波刺激（TBS）的切片与仅接受基线刺激（CON；第页>0.3，双尾t吨test），而切片在2n存在下用两次θ脉冲处理米BDNF（TBS+BDNF）具有大约三倍数量的强标记棘(**第页<0.01 vs TBS单独）。C在给接受aCSF（CON）或BDNF输注的切片注射两次θ波之前（0′）和之后（15′）15分钟立即记录现场EPSP（记录前20分钟开始）。
图6。
图6。
固定细胞外BDNF可防止TBS诱导的肌动蛋白聚合。A类CA1取样区域的代表性显微照片显示，在仅给予TBS的切片中，密集的卵磷脂标记的脊椎散射，在给予TBS且含有1μg/ml TrkB-Fc（TBS+TrkB-Flc；比例尺，10μm）的切片中没有密集的脊椎标记。B类组平均值±扫描电镜脊柱计数图证实，TBS显著增加了与对照组相比的强标记脊柱数量（CON***第页=0.001，双尾t吨试验），该效应被TrkB–Fc阻断(第页>0.8 vs对照组）。C，累积分数脊柱强度图（如图3所示H（H）)显示了在aCSF中保存的对照切片（虚线）和仅用1μg/ml TrkB–Fc处理的切片（实线；即在没有TBS的情况下）的卵磷脂标记脊柱的类似强度分布：在TrkB-Fc和aCSF切片之间未检测到差异(第页>0.8，双向重复测量方差分析）。天在TBS后30秒开始，在接受对照Ig、IgG–Fc（TBS+IgG-Fc）或2μg/ml TrkB–Fc的切片中，在CA1区罗丹明–指骨肽标记2分钟的显微照片。E类，密标棘的定量显示，TBS后应用IgG–Fc并没有阻止θ诱导的密标棘数量的增加(**第页与对照组相比<0.01，双尾t吨试验），而TBS后输注TrkB–Fc消除了这种影响。
图7。
图7。
外源性BDNF促进肌动蛋白调节蛋白的磷酸化。A类，高倍共焦显微照片显示CA1区域中的抗PSD-95（绿色）和抗PAK3（红色）双标记（双标记元素显示为黄色）。这两个标记都标记了分散在整个放射状茎上的离散点。比例尺：A类，5微米；B类，3微米。B类，字段的放大，包括中的箭头A类分为红色（PAK3）、绿色（PSD-95）和叠加（合并）通道(A类是一幅“合并”的图像）显示，大多数（但不是全部）PAK3免疫反应性点刺也含有PSD-95-IR。C，显微照片显示PAK3-IR（左）和指骨素标记的F-actin（右）的核周定位。天,E类，用BDNF（60 ng/ml；浴）单独或TrkB-Fc预处理成年大鼠海马脑片30 min。典型的Western印迹(天)显示对p-PAK免疫反应的治疗效果（检测p-PAK亚型1、2和3上保守的磷酸化位点），而总PAK3没有明显变化。TrkB-Fc以剂量依赖性方式消除BDNF诱导的p-PAK增加。BDNF同样增加，TrkB–Fc同样减少，对cofilin总含量没有影响。E类，定量Western blot，评估BDNF治疗对p-PAK（顶部）和p-cofilin（底部）免疫反应的影响，有无TrkB-Fc协同治疗（显示组平均值±SEM带密度；n个=每组8个）。在每种情况下，BDNF诱导的磷酸蛋白增加(*第页与对照组相比，TrkB–Fc在0.2–2μg/ml（p-PAK）和1–2μg/ml（p-cofilin）浓度下阻断了单向方差分析（随后进行Tukey HSD试验）。
图8。
图8。
BDNF清除剂TrkB–Fc在θ突发刺激后应用，破坏LTP巩固。A类代表性的fEPSP轨迹显示，当TrkB-Fc（2μg/ml）在TBS后30秒开始施加2分钟时，传统θ突发序列产生的突触增强程度减弱。在基线（0′）和TBS（30′）后30分钟采集右侧（2μg/ml TrkB-Fc）的轨迹。在清洗清除剂27分钟后，使用第二组突触（控制通路；左侧痕迹）重复实验。在这种情况下，获得正常的TBS诱导的增强（TBS后30分钟）。B类图中显示了上述实验的组fEPSP斜率（平均值±SEM）。请注意，接受TBS TrkB–Fc治疗后的通路（填充圆）的增强，尽管最初很稳健，但与控制通路（开放圆）中的增强相比显著衰退；此处和后面面板中的箭头指示TBS的位置。C，与中相同B类但TBS后30 s注射对照IgG–Fc（2μg/ml）；这对LTP没有影响。天TBS后10分钟开始输注TrkB–Fc 2分钟对LTP无影响。E类,F类，诱导后输注TrkB–Fc或IgG–Fc获得的LTP百分比总结：数值是输注开始后30分钟测得的与基线相比的百分比变化；在顶部树突（放射状树突）和底部树突（东方树突）中进行的测试总结如下E类和F类分别是。与IgG–Fc治疗的对照组相比，在TBS后30秒应用TrkB–Fc后，两个椎板的LTP表达均减弱(*第页<0.05，双向重复测量方差分析（ANOVA），然后是Tukey的HSD），但在以后的时间点没有改变增强。
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