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.2007年3月12日；176(6):795-805.
doi:10.1083/jcb.200701066。 Epub 2007年3月5日。

着丝粒染色质的繁殖需要有丝分裂的退出

拉尔斯·E·T·詹森 1, 本·E·布莱克, 丹尼尔·福尔茨, 唐·W·克利夫兰
附属公司

着丝粒染色质的繁殖需要有丝分裂的退出

拉尔斯·E·T·詹森等人。 J细胞生物学. .

摘要

着丝粒通过动粒的成核组装直接进行染色体遗传，动粒是有丝分裂期间微管附着所需的一种大型多蛋白复合体。人类的着丝粒身份是由表观遗传学决定的，没有必要或足够的DNA序列。表观遗传标记的主要候选是组装成着丝粒蛋白A（CENP-A）的着丝粒染色质，这是一种仅在功能着丝粒上发现的组蛋白H3变体。现已开发出一种使用SNAP标记的新共价荧光脉冲相位标记方法，并用于证明与成熟着丝粒结合的CENP-A在数量上与S期产生的姐妹着丝粒等分，从而通过多个细胞分裂保持稳定的结合。新生CENP-A在复制的着丝粒DNA的巨碱基结构域上的负载被证明需要通过有丝分裂，但不需要微管附着。令人惊讶的是，含有CENP-A的新核小体的组装和稳定仅限于随后的G1期，这表明有丝分裂的进展与下一代着丝粒的组装/成熟之间存在直接耦合。

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数字

图1。
图1。
基于SNAP标签的脉冲标记原理。（A和B）CENP-A-SNAP融合蛋白与BG（BG-block；quench）或TMR的脉冲相位标记（A）或quench-case-pulse标记（B）的标记策略示意图-星星（脉冲）。（C） SNAP标签可以使用荧光TMR在体内有效标记-星星（顶部）和使用非荧光BG淬火（底部）。CENP-A–SNAP细胞用TMR标记-星星15分钟或在TMR前用BG阻断剂处理30分钟-星星用抗HA标记和处理免疫荧光。（D） TMR公司-星星–标记的CENP-A–SNAP是着丝粒定位的。细胞为TMR-星星标记15分钟并用抗CENP-C进行免疫荧光处理。
图2。
图2。
CENP-A重心营业额。（A） CENP-A周转的细胞同步和标记方案概述。如图所示，细胞同步并标记，然后用抗HA进行固定和免疫荧光。显示了每个时间点的代表性图像。在一个和两个细胞周期后，检测到标记为CENP-A的脉冲追踪-SNAP残留（两个细胞循环[50 h]后的插入物被额外放大3倍，并缩放强度以显示剩余的着丝粒荧光）。（B） 平均TMR的量化-星星指示时间点的强度。在有丝分裂过程中，每个分裂处的信号都明显减少，在此过程中，姐妹着丝粒分裂，可以单独解决。在每次测量中，对10个不同细胞中至少500个着丝粒进行量化。误差线代表着丝粒强度的SEM。AU，任意单位。
图3。
图3。
CENP-A负荷在末期/G1早期开始。（A） 单元同步和标记协议示意图。细胞周期阶段是根据双胸腺嘧啶核苷诱导的G1-S期阻滞释放后经过的时间来估计的。显示了每个时间点的代表性图像。（B） 胸腺嘧啶核苷释放后11小时显示有丝分裂的不同阶段。（C） TMR阳性细胞百分比-星星胸腺嘧啶核苷释放后，在指定的时间点（估计的细胞周期阶段低于）出现荧光。括号中的数字表示每个时间点计数的单元格数。（D和E）G1早期着丝粒处CENP-A-SNAP组件的活细胞时间延迟。（D） 细胞同步和标记协议示意图，用于G1早期着丝粒处CENP-A-SNAP组件的活细胞延时成像。在SNAP标记方案前48 h，用YFP–CENP-C表达结构瞬时转染CENP-A–SNAP细胞。（E） 中期细胞退出有丝分裂并装配CENP-a–SNAP的代表性静止物，持续约4小时（视频1，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200701066/DC1). TMR的一部分-星星染料非特异性地保留在细胞外围附近（可能在内膜中；白色箭头），但没有TMR-星星此时在着丝粒处检测到信号（与YFP–CENP-C[红盒]共定位）。时间点与后期发病有关。方框中的区域突出显示了在着丝粒处CENP-A–SNAP的初始缺失，以及在后期开始后50分钟内最早检测到CENP-A-SNAP，并持续组装到260分钟。所有图像的深度随时间变化都是相等的。
图4。
图4。
新生代CENP-A仅在G1期间加载。（A） 细胞同步和后期G1标记协议示意图。（B） 指定时间点的典型图像。加载CENP-A的电池百分比如下所示。请注意，在9.5小时内加载CENP-A的细胞中，11%的细胞代表已经进入下一个G1期的细胞，诺可唑在有丝分裂过程中阻断的细胞中没有加载CENP_A就可以证明这一点。
图5。
图5。
内源性CENP-A的着丝粒水平在G1期增加。（A） 稳定表达YFP–CENP-A的HeLa细胞（Kops等人，2004）或亲本HeLa电池通过胸腺嘧啶核苷串联处理同步化并释放，有丝分裂或G1–S边界的细胞直接成像（YFP荧光）在活细胞中或用抗CENP-A进行间接免疫荧光处理（细胞周期未按比例绘制）。（B） 量化CENP-A平均强度。对于YFP–CENP-A，来自>10个细胞的>600个着丝粒，对于内源性CENP-A-，来自5个不同细胞的>200个着丝束在每次测量中都被量化。误差条代表着丝粒强度的SEM。AU，任意单位。
图6。
图6。
有丝分裂通道对G1早期CENP-A的负载至关重要。（A） 细胞同步、标记和聚乙二醇介导的细胞-细胞融合协议示意图。标记有H3-CFP或CFP-tubulin的CENP-A-SNAP细胞从双胸苷块中依次释放，而之前组装的CENP_A-SNAP被猝灭。在PEG介导的融合时，H3-CFP和CFP微管蛋白细胞处于G1或G2期，其频率基于负载CENP-A–SNAP的细胞部分。PEG融合后，添加诺卡唑以阻止任何额外的有丝分裂通道，并在额外4小时后通过TMR测定双核异核体中CENP-A-SNAP的负载量-星星标记。（B） 双核异核体双标记H3-CFP和CFP-tubulin的典型图像，其中两个、一个或没有一个细胞核在着丝粒处组装了CENP-A-SNAP。（C） 双核异核体的频率，其中两个、一个或没有一个核在所示群体融合中的着丝粒（TMR阳性核）加载CENP-A–SNAP。G2-G1细胞融合实验条形图中的箭头表示融合时处于G1期（红色）或G2期（蓝色）的H3-CFP细胞的比例。每个实验至少分析30个双核异核体。
图7。
图7。
CENP-A在着丝粒的组装不需要有丝分裂中的微管附着。（A） 细胞同步、转染和标记方案示意图。（B） 在S/G2晚期用转录介导的BubR1 RNAi基因瞬时转染的细胞的代表性图像，之后用胸苷再次阻断细胞。在用BG淬灭CENP-A–SNAP后，释放胸腺嘧啶抑制，然后添加诺卡唑来阻断纺锤体微管组装。新制造的CENP-A–SNAP用TMR脉冲标记-星星在随后的S/G2中（胸腺嘧啶释放后8小时）。胸腺嘧啶核苷释放后15小时，三个细胞中的两个（1和2）处于分裂前状态（基于与未解析的姐妹着丝粒对一致的着丝粒数），并且未装载CENP-A-SNAP，而第三个细胞在没有染色体分离和胞质分裂的情况下退出有丝分裂（着丝粒数量与8N DNA含量一致，其中姐妹着丝粒被分解），并且装载了CENP-A-SNAP。每个细胞的着丝粒数显示在HA图像中。（C） 如图所示，在A中操作siRNAs后加载CENP-A的细胞百分比。括号中的数字表示为每个条件计算的单元格数。（D） 有（TMR阳性；红色）或无（TMR阴性；蓝色）CENP-A负载的细胞着丝粒数的频率分布。
图8。
图8。
与细胞周期相关的着丝粒染色质组成示意图。含CENP-A的核小体（红色）在S期复制后与典型的含H3核小体散布在一起（绿色），这组混合核小体是有丝分裂中成核动粒组装的底物，并在细胞后期退出时维持。CENP-A组装在末期开始，并在G1早期进行（可能与H3核小体的移除同时进行）。CENP-A和H3核小体被定为单个核小体，但可能代表一种或另一种类型的连续交替排列。在有丝分裂过程中，CENP-A核小体可结合形成刚性界面，用于动粒形成（Zinkowski等人，1991；Blower等人，2002；Black等人，2004，b）。
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中的注释

  • 着丝粒染色质被加载。
    卡罗尔CW，直AF。 Carroll CW等人。 细胞生物学杂志。2007年3月12日；176(6):735-6. doi:10.1083/jcb.200702020。Epub 2007年3月5日。 细胞生物学杂志。2007 PMID：17339381 免费PMC文章。

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    卡罗尔CW，直AF。 Carroll CW等人。 细胞生物学杂志。2007年3月12日；176(6):735-6. doi:10.1083/jcb.200702020。Epub 2007年3月5日。 细胞生物学杂志。2007 PMID：17339381 免费PMC文章。
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