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.2007年3月1日；53(5):639-47.
doi:10.1016/j.neuron.2007.01.033。

单个基因靶向神经元跨突触追踪的单突触限制

Ian R Wickersham先生 1, 大卫·C·里昂, 理查德·巴纳德, 森喜昭（Takuma Mori）, 斯特凡·芬克, 卡尔·克劳斯·康泽尔曼, 约翰·A·T·杨, 爱德华·M·卡拉威
附属公司

单个基因靶向神经元跨突触追踪的单突触限制

Ian R Wickersham先生等。 神经元. .

摘要

从来没有一种大规模的方法来识别与其他细胞群或特别是单个细胞单突触连接的神经元。可用的最佳工具，跨突触示踪剂，无法区分弱直接联系和强间接联系。此外，从单个细胞开始，没有任何示踪剂被证明足以标记任何连接的神经元。在这里，我们提出了一种仅跨越一个突触步骤的跨突触示踪剂，明确地将突触前细胞直接识别为起始群体。它以狂犬病病毒为基础，在基因上具有针对性，可以在突触耦合神经元中高水平表达任何感兴趣的基因，并牢固地标记与单个细胞的连接。这项技术应该能够比以前更详细地了解神经连接。

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数字

图1
图1。跨复合突触追踪
（A） 将缺失一个或多个跨突触传播所需基因以及单独缺失的病毒基因的缺失突变追踪病毒引入感兴趣的细胞或细胞类型。最初的感染和补充病毒基因都必须局限于感兴趣的神经元群体。（B） 由于所有病毒基因都存在于最初感染的人群中，病毒可以通过突触传播到与之直接突触接触的细胞。然而，由于这些细胞中没有缺失的病毒基因，病毒无法进一步传播。（C） 狂犬病病毒。病毒核心由RNA基因组和相关蛋白组成，并由宿主细胞衍生膜包围，其中嵌入狂犬病病毒糖蛋白（G）。EGFP基因取代了病毒基因组中的糖蛋白（中心）。这种病毒的版本可以结合其天然糖蛋白（命名为SADΔG-EGFP，右上）或其他一些病毒的糖蛋白。在这项研究中，狂犬病病毒是用来自ASLV-A的糖蛋白假分型的，称为EnvA，该病毒被命名为SADΔG-EGFP（EnvA）（右下图）。（D） 针对感染。除非将ASLV-A受体基因TVA引入哺乳动物神经元，否则ASLV-A-伪型狂犬病病毒[SADΔG-EGFP（EnvA）]不能感染哺乳动物神经元。这导致受体在细胞表面表达，从而被假型病毒感染。因此，系统的基本要求如下。首先在感兴趣的细胞或细胞类型中插入两个基因：TVA基因，这样病毒就可以进入；狂犬病病毒糖蛋白基因，这样，病毒就可以传播到突触偶联的细胞。然后应用ASLV-A假型病毒。（E） 遵循这些步骤，TVA表达细胞发生特异性感染；与狂犬病病毒糖蛋白的互补使病毒能够直接传播到突触前神经元。这些细胞都表达病毒基因组中编码的EGFP，但病毒不能传播到这些直接连接的细胞之外，因为它们不表达病毒糖蛋白。
图2
图2。切片培养中的选择性感染和原位补体
（A–D）最初感染仅限于表达ASLV-A受体TVA的细胞。在这些检测感染选择性的对照实验中，使用基因枪将培养脑片中分离的神经元转染为两个基因，一个编码TVA，另一个编码DsRed2。第二天应用ASLV-A伪型狂犬病病毒[SADΔG-EGFP（EnvA）]，并在第六天拍摄图像。（A和C）DsRed2表达标记TVA转染和（B和D）EGFP表达，表明同一TVA表达细胞随后选择性感染假型病毒。（E–H）原位互补允许跨突触从最初感染的单个细胞传播到单突触连接的细胞簇。用编码TVA的三个基因转染分离的神经元以允许病毒感染，用DsRed2标记转染细胞，用狂犬病病毒糖蛋白基因补充病毒基因组中的缺失。（E） DsRed2荧光表示转染细胞，用虚线标记，位于（F）所示簇的中心。（G和H）围绕单个转染细胞的另外两个集群示例。最初表达EGFP和DsRed2的感染细胞呈黄色。比例尺：200μm。
图3
图3。跨编译跟踪的更多示例
（A–C）长程病毒从最初感染的单个细胞传播。（A） 感染后8天，一个巨大的绿色细胞簇围绕着一个红色/绿色深层皮质神经元（虚线）。另一个密集的细胞簇也感染了紧邻其上的表层皮层，这与已知的表层向深层的投射相一致；远处深层锥体细胞也受到感染，这与已知的长程层内连接模式再次一致。假定最初感染的细胞左侧是第二个黄色（双标）细胞，由于周围缺乏绿色细胞，显然是第二次和最近感染的。（B–C）（a）中心簇的特写。（D–F）更多原位互补的例子：感染细胞簇围绕着孤立的突触后细胞。比例尺：200μm。
图4
图4。病毒传播是特异性的细胞突触前对最初感染的细胞
（A） 靶向突触前和突触后神经元的切片和记录吸管的DIC图像，（B）组合荧光图像，以及（C–D）单通道荧光图像。（E） 假定突触后细胞中的抑制性突触后电流与附近感染细胞的动作电位一致，表明存在单突触连接。（F–J）向兴奋性突触前细胞扩散的类似证据。比例尺：100μm，适用于所有面板。
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