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.2007年5月；27(9):3282-9.
doi:10.1128/MCB.01927-06。 Epub 2007年2月26日。

细胞渗透α-酮戊二酸衍生物缓解琥珀酸脱氢酶缺乏细胞的假性缺氧

伊莱恩·德·麦肯齐 1, 玛丽·A·塞拉克, 丹尼尔·坦南特, 劳埃德·J·佩恩, 斯图亚特·克罗斯比, 卡斯珀·弗雷德里克森, 大卫·G·沃森, 埃亚尔·戈特利布
附属公司

细胞渗透α-酮戊二酸衍生物缓解琥珀酸脱氢酶缺乏细胞的假性缺氧

伊莱恩·德·麦肯齐等。 分子细胞生物学. 2007年5月.

摘要

琥珀酸脱氢酶（SDH）和富马酸水合酶（FH）是三羧酸（TCA）循环和肿瘤抑制剂的组成部分。SDH或FH的丢失会导致假性缺氧，这是一种主要的肿瘤支持事件，是在常压下低氧诱导因子（HIF）的激活。在SDH或FH缺陷细胞中，HIF激活是由于分别通过琥珀酸或富马酸稳定HIF1-α，其中任何一种过量都会抑制HIFalpha脯氨酰羟化酶（PHD）。为了重新激活PHD，我们关注其底物α-酮戊二酸。我们设计并合成了渗透细胞的α-酮戊二酸衍生物，这些衍生物在TCA循环功能失调的细胞中快速优先建立。本研究表明，琥珀酸或富马酸介导的PHD抑制作用是竞争性的，并可通过药物升高细胞内α-酮戊二酸来逆转。引入α-酮戊二酸衍生物可使SDH抑制细胞恢复正常的PHD活性和HIF1-α水平，这表明与TCA周期功能障碍相关的癌症有新的治疗可能性。

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数字

图1。
图1。
琥珀酸介导的PHD抑制作用可以通过增加体外α-酮戊二酸水平来克服。在体外用指定量的琥珀酸和α-酮戊二酸（αKG）进行ODD结构域的羟基化反应。ODD羟基化(哦-ODD）导致SDS-PAGE上出现快速迁移带。
图2。
图2。
经α-酮戊二酸酯衍生物处理的细胞内α-酮戊二酸水平升高。（a） GDH反应示意图。（b） NADH的减少（通过340 nm处的光吸收测定）与添加到GDH反应中的α-酮戊二酸的化学计量比。（c） HEK293细胞未经处理或用1mM所示的α-酮戊二酸衍生物或用未衍生的α-酮戊二酸处理。如图b所示，使用GDH反应分析细胞提取物中的α-酮戊二酸水平。（d）HEK293细胞转染对照Sc或靶向shRNAsSDHD公司（Di3或Di4）和48小时后，细胞要么未经处理，要么用1 mM辛基-α-酮戊二酸处理。在小组b和c中分析了α-酮戊二酸的细胞内水平。aKG是未激活的α-酮戊二酸；OaKG、TaKG和BaKG分别是辛基、TFMB-和苄基-α-酮戊二酸酯。误差线表示标准偏差。
图3。
图3。
细胞内α-酮戊二酸水平的增加减轻了琥珀酸对PHD活性的抑制。（a，左）通过Western blotting分析共表达GFP-ODD融合蛋白和HA标记pVHL的克隆（C2和C3）。用仅编码GFP的质粒瞬时转染的细胞作为GFP分子量（Co）的参考。肌动蛋白被用作加载控制。（右）克隆3（C3）细胞未经处理（U）或用低氧化合物CoCl处理2通过Western blotting分析（CC）、GFP-ODD和HA-pVHL蛋白水平。（b） 克隆3细胞要么未经处理，要么用氯化钴处理2或25 mM丁二酸二甲酯（DMS）48 h。如有指示，在培养的最后12 h添加1 mMα-酮戊二酸衍生物（与丁二酸二甲酯），并在显微镜下观察GFP-ODD水平。（c） 克隆3细胞按b组处理，通过Western blotting检测GFP-ODD水平。氯化钴2-处理细胞（CC）作为PHD抑制的阳性对照，肌动蛋白水平作为负荷对照。（d） 克隆3细胞要么未经处理（U），要么用丁二酸二甲酯（DMS）处理，要么加入或不加入TFMB-α-酮戊二酸。Western blotting检测GFP-ODD和HIF1α水平。肌动蛋白被用作加载控制。（e） 克隆3细胞按d组处理，蛋白裂解物用抗GFP（多克隆）抗体免疫沉淀。使用抗GFP（单克隆）抗体和抗HA抗体通过蛋白质印迹分析免疫沉淀（IP）之前（2%输入）或之后的裂解物。OaKG和TaKG分别是辛基和TFMB-α-酮戊二酸酯。
图4。
图4。
α-酮戊二酸酯克服了琥珀酸或富马酸介导的HIF1α稳定性。（a） 用打靶SDHD（Di3）的干扰对照Sc或shRNA转染HEK293细胞。如有指示，在转染48小时后添加α-酮戊二酸衍生物，然后进行HIF1α的Western blot分析。肌动蛋白水平被用作负荷控制。（b） 在提取之前，HCT116细胞用或不用2 mM单乙基叶酸处理24 h和/或2 mM TFMB-α-酮戊二酸酯处理最后2 h。Western blot分析与a组相同。（c）ARPE细胞未经处理或用指示量的单乙基-呋喃甲酸钠处理3小时，添加或不添加2 mM辛基-α-酮戊二酸酯。与面板a一样进行蛋白质印迹分析。（d）HEK293细胞未经处理或用0.5 mM CoCl处理2使用或不使用2 mM所示α-酮戊二酸衍生物2 h。Western blot分析与a组相同。（e）ARPE细胞未经处理，或用2 mM单乙基叶酸和/或2 mM TFMB-α-酮戊二酸酯处理。Western印迹法检测HIF1α、HIF2α、pVHL和肌动蛋白的内源性蛋白水平。U、 未经处理；CC、氯化钴2; MEF，戊二酸单乙酯；OaKG，辛基-α-酮戊二酸；TaKG，TFMB-α-酮戊二酸；BaKG，苄基-α-酮戊二酸。
图5：。
图5：。
α-酮戊二酸对HIF1α进行重定位，以实现泛素化和蛋白酶体介导的降解。（a） ARPE细胞未经处理，或在细胞裂解前30分钟加入或不加入2 mM辛基-α-酮戊二酸酯的情况下，用2 mM单乙基-戊酸酯处理24小时。如有指示，在α-酮戊二酸衍生物前30分钟将蛋白酶体抑制剂MG132添加到细胞中。Western blotting分析HIF1α和肌动蛋白作为负荷对照。（b） 亲代RCC4细胞(VHL（甚高频）负）第页，共页VHL（甚高频）-如图所示，转染的RCC4细胞要么未经处理，要么用2 mM单乙基呋喃甲酸盐处理，要么不加2 mM TFMB-α-酮戊二酸盐。通过Western blotting分析HIF1α和肌动蛋白作为负荷对照。（c） ARPE细胞未经处理或用2 mM富马酸单乙酯处理12 h，添加或不添加TFMB-α-酮戊二酸酯。糖酵解率按材料和方法中的描述进行分析。U、 未经处理；MEF，戊二酸单乙酯；OaKG，辛基-α-酮戊二酸；TaKG，TFMB-α-酮戊二酸。
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