A matrix metalloproteinase-9 activation cascade by hepatic stellate cells in trans-differentiation in the three-dimensional extracellular matrix

doi:10.1074/jbc.M700554200

.2007年4月27日；282(17):12928-39.

doi:10.1074/jbc。M700554200。 Epub 2007年2月23日。

三维细胞外基质中肝星状细胞转分化过程中基质金属蛋白酶-9的激活级联

韩元平¹, 甄春丽, 凌州, 蓝琴, 冢本秀一（Hidekazu Tsukamoto）

附属公司

PMID： 17322299
PMCID公司：第376818页
内政部： 10.1074/jbc。M700554200型

三维细胞外基质中肝星状细胞转分化过程中基质金属蛋白酶-9的激活级联

韩元平等。生物化学杂志. 2007.

.2007年4月27日；282(17):12928-39.

doi:10.1074/jbc。M700554200。 Epub 2007年2月23日。

作者

韩元平¹, 甄春丽, 凌州, 蓝琴, 津本英和

附属

¹美国加利福尼亚州洛杉矶市南加州大学凯克医学院外科，邮编90033-4680。yhan@surry.usc.edu

PMID： 17322299
PMCID公司：项目经理2376818
内政部： 10.1074/jbc。M700554200型

摘要

肝星状细胞（HSC）在肝纤维化发生中经历肌纤维母细胞转分化。我们之前的研究表明，三维I型胶原和白细胞介素-1（IL-1）的双重刺激以依赖基质金属蛋白酶-9（MMP-9）激活的方式协同诱导HSC转分化。本研究旨在确定MMP-9在该模型中的激活机制。转分化HSC表达的前MMP-9转化活性被描述为对MMP抑制剂敏感的分泌因子，其表观分子量为50和25kDa。这与小鼠和人类皮肤中的前MMP-9激活物形成鲜明对比，后者是一种糜蛋白酶样蛋白酶。在双重刺激诱导HSC产生的多种MMPs中，MMP-13表达上调最为显著，符合作为MMP-9前激活物的所有标准。在三维I型胶原中培养的HSC，而在Matrigel中没有，IL-1分别在50和25 kDa时诱导MMP-13及其成熟形式的表达。体外重组实验证明，MMP-13（而非其酶原）激活前MMP-9。此外，以MMP-13为靶点的短发夹RNA可消除前MMP-9活化和HSC转分化。我们进一步证明，膜相关因子促进了前MMP-13的活化，金属蛋白酶组织抑制剂-2抑制了前MMP-13的活化，而针对MMP-14的短发夹RNA则消除了其活化。此外，前MMP-13也被一种分泌因子激活，该分泌因子被明胶-Sepharose吸收并与MMP-9重组。因此，MMP激活级联（MMP-14>MMP-13>MMP-9）和MMP-9>MMP-13的正反馈回路促进了IL-1诱导的三维细胞外基质中HSC的转分化，表明它们在肝脏损伤和修复中的关键作用。

PubMed免责声明

数字

**图1。IL-1诱导MMP-9表达/激活与三维I型胶原HSC转分化的时间相关性**
A类，将分离的大鼠HSC包埋在三维I型胶原中，并用IL-1处理α（0.5纳克/毫升）。细胞固定在指定的时间点，用于免疫荧光染色α-SMA和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚。B类条件培养基中的MMP-9通过酶谱图进行解析。C类通过I型胶原晶格的塌陷监测ECM的整体降解。

**图2。遗传和药理学证据表明MMP-9在IL-1诱导三维胶原中HSC转分化中的重要作用**
A类、从野生型和MMP-9基因敲除中分离出的HSC(*击倒对手*)小鼠在相差显微镜下和紫外线下检查自身荧光（维生素A滴）。B类，将细胞包埋在I型胶原中或在塑料上培养。加入或不加入IL-1培养5天后α，细胞被染色α-座椅模块组件。C类，将大鼠HSC嵌入三维I型胶原中，并用IL-1刺激α在MMP抑制剂存在或不存在的情况下。培养5天后，对细胞进行染色α-座椅模块组件。D类肽裂解法测定Ⅳ型胶原酶活性。电子MMP抑制剂可消除重组间质胶原凝胶的整体分解。

**图3。HSC分泌的前MMP-9转换活性分子量分别为50和25kDa**
A类去除内源性明胶酶后，在胶原中培养的HSC条件培养基中加入IL-1α用或不用纯化的人MP-9原孵育5天。16小时后，通过酶谱图解决反应。B类用Superdex-200对条件培养基进行拆分，然后用纯化的pro-MMP-9孵育，然后进行酶学分析。C类，通过非还原性SDS-PAGE将条件培养基溶解，然后根据分子量将凝胶切片为20片。将切片与pro-MMP-9孵育后，通过酶谱分析确定转化活性。50kDa和25kDa时的转换活动表示为箭头.

**图4。HSC和皮肤使用不同的机制激活MMP-9前体**
A类在内源性明胶酶耗尽后，将胶原蛋白中HSC与IL-1的条件培养基与人MMP-9原在有或无蛋白酶抑制剂的情况下孵育，如图所示。孵育16小时后，反应通过酶谱图进行解析。B类，用1%Triton X-100、6 M尿素和2 M氯化钠依次提取正常人皮肤。透析后，将最终提取物与前MMP-9和蛋白酶抑制剂孵育。16小时后，反应通过酶谱法分解。

**图5。HSC表达的MMPs和TIMPs对IL-1和I型胶原的反应**
A类，将分离的大鼠HSC嵌入三维I型胶原中，然后用IL-1治疗α提取RNA并转化为cDNA。通过Affymetrix DNA微阵列筛选MMPs和TIMPs的表达。白介素-1α-MMPs的诱导表达表现为基底水平的折叠变化。“A类“代表缺席。B类HSC在塑料或三维I型胶原上培养16 h，加入或不加入IL-1。通过定量RT-PCR测定MMPs的mRNA水平。

**图6。基质金属蛋白酶-13的缺失导致基质金属蛋白酶-9前体缺乏激活**
A类将分离的大鼠HSC接种在塑料上或嵌入I型胶原或基质中，然后用IL-1刺激α.按规定的间隔对经调节的培养基进行取样。用识别MMP-13铰链区的单克隆抗体通过Western blot检测MMP-13的表达/激活。B类在规定条件下培养5天的HSC条件培养基通过酶谱图进行解析。

**图7。活性MMP-13，但不是其酶原，激活前MMP-9**
A类将纯化的活性MMP-13和pro-MMP-13按指示剂量与纯化的pro-MMP-9孵育16 h，然后进行酶谱分析。B类在有或无MMP抑制剂或凝乳抑素的情况下，将活性MMP-13与前MMP-9孵育16小时，然后进行酶谱分析。

**图8。MMP-13的敲除消除HSC-介导的前MMP-9激活**
A类用质粒（pENTR/U6）转染分离的大鼠HSC，该质粒可传递shRNA对抗MMP-13和lacZ。转染4小时后，将细胞包埋在I型胶原中，并用IL-1刺激α通过酶谱分析前MMP-9的表达和激活。B类Western blot检测MMP-13的下调。C类和D类在三维培养的细胞中，用编码MMP-13 shRNA的腺病毒转导细胞可消除前MMP-9的激活，而对酶原的表达无任何影响。电子、编码MMP-13和lacZ shRNA的腺病毒转导的细胞表型。shRNA对MMP-13胶原蛋白分解的抑制作用由插入.

**图9。膜型MMP-14介导前MMP-13的激活**
A类Western blot检测HSC在含或不含IL-1的三维I型胶原中2天MMP-14的表达。B类将TIMP-2加入三维培养物中培养3天。通过Western blot和酶谱分析分别检测TIMP-2对前MMP-13和前MMP-9活化的抑制作用。指出了这些基质金属蛋白酶的成熟形式和可能的催化域。C类，用HSC在含有或不含IL-1的三维胶原中制备粗膜组分2天。将组分与pro-MMP-13孵育指定时间，然后进行MMP-13的Western blot分析。D类将含有IL-1的三维培养物的膜组分与pro-MMP-13和TIMP-2共同孵育。孵育后，通过Western blot分析测定pro-MMP-13的活化。电子以编码MMP-14 shRNA的腺病毒或lacZ作为对照，通过HSC转导MMP-14。通过定量RT-PCR测定MMP-14 mRNA的下调效率。F类，通过蛋白质印迹分析评估MMP-14的下调对MMP-13激活的抑制作用。

**图10。MMP-9激活前MMP-13的正反馈回路和MMP激活级联**
A类收集含有IL-1的三维胶原HSC条件培养基2天，并在有或无MMP抑制剂的情况下将混合物培养额外时间。通过Western blot分析测定内源性前MMP-13的激活。B类，条件培养基中的明胶酶被明胶Sepharose 4B耗尽。将原始培养基和耗尽的条件培养基培养额外时间，并通过明胶酶酶谱和MMP-13的Western blot进行解析。C类，将活性人MMP-9添加回缺乏明胶酶的条件培养基中。孵育后，MMP-13被Western blot溶解。D类，阐明了所提出的三维ECM中HSC对IL-1刺激的MMP激活级联的模型。

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