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.2007年3月7日；26(5):1257-67.
doi:10.1038/sj.emboj.7601596。 Epub 2007年2月22日。

TNFalpha的细胞毒性受整合素介导的基质信号调节

Chih-Chiun Chen先生 1, 詹妮弗·杨, 里卡多·蒙森, 陈宁宇, 维克托·托多罗维奇, 莱斯特·F·刘
附属公司

TNFalpha的细胞毒性受整合素介导的基质信号调节

Chih-Chiun Chen先生等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

肿瘤坏死因子（TNF）家族的细胞因子调节炎症和免疫，该家族的一个子家族也能以依赖于环境的方式诱导细胞死亡。虽然TNFalpha对某些肿瘤细胞株具有细胞毒性，但只有当NFkappaB信号被阻断时，它才能诱导正常细胞凋亡。在此，我们表明，基质细胞蛋白CCN1/CYR61可以在不干扰NFkappaB信号或从头合成蛋白的情况下揭开TNFalpha的细胞毒性潜力，从而导致原代耐药人成纤维细胞的快速凋亡。CCN1通过结合整合素α（v）β（5）、α（6）β（1）和syndecan-4发挥作用，通过5-脂氧合酶和线粒体的Rac1依赖机制触发活性氧物种（ROS）的生成，导致凋亡所必需的JNK的双相激活。基因组Ccn1位点被凋亡缺陷的Ccn1等位基因取代的小鼠对TNFα诱导的体内凋亡具有实质性抵抗力。这些结果表明，CCN1可能作为TNFα细胞毒性的生理调节器，为TNFα介导的细胞死亡提供来自细胞外基质的背景线索。

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数字

图1
图1
成纤维细胞粘附CCN蛋白使TNFα诱导凋亡。原发性HSF按所述进行治疗，如有指示，暴露于CCN1和/或TNFα4.5小时。凋亡细胞被记为浓缩细胞核。(A类)在无血清培养基中，将HSF粘附在涂有纯化CCN1、CCN2、CCN3或FN的玻璃盖玻片上，并用TNFα或载体处理（对照）。细胞进行TUNEL分析并用DAPI进行复染以评估凋亡。(B类)对（A）中处理的细胞中凋亡细胞核的百分比进行量化，包括粘附在FN、LN、VN、Col.I和FBN上的细胞核(C类)用可溶性CCN1和/或TNFα处理粘附在基质基质上的细胞，并对细胞凋亡进行评分。(D类)HSF在含有10%FBS的培养基中培养2天，以允许内源性ECM沉积。在血清饥饿后，用不同浓度的CCN1处理细胞，如有或无TNFα所示。在整个研究中，所有条形图均显示了三次测定平均值的标准偏差。本研究中的每个实验重复至少三次，结果相似；给出了一个具有代表性的实验。
图2
图2
CCN1/TNFα诱导细胞凋亡所需的受体。原发性HSF接受如下所述的各种治疗，然后用可溶性CCN1、TNFα或两者治疗4.5小时，然后进行凋亡评分。(A类)在用CCN1和TNFα治疗前，用中和TNFRI、TNFRII的100μg/ml单克隆抗体或抗syndecan-4多克隆抗体（100μg/ml）或正常兔IgG预先培养HSF 30分钟。(B类)在用CCN1和/或TNFα治疗之前，用各种抑制性单克隆抗体（50μg/ml）培养细胞。使用的抗体包括GoH3（抗整合素α6)，P5D2（抗β1)，LM609（抗αv（v）β三)，P1F6（抗αv（v）β5)和正常小鼠IgG。(C类)用CCN1或突变株DM、TM或D125A（各4μg/ml），或DM和D125A的联合治疗HSF，无论是否有TNFα。
图3
图3
CCN1/TNFα诱导的凋亡独立于NFκB信号转导，但完全依赖于ROS的积累和随后的双相JNK1/2激活。HSF接受所述的各种处理，并与CCN1、TNFα、CHX或所示的组合孵育。(A类)成纤维细胞在含有1μCi/ml35S-蛋氨酸与CCN1和/或TNFα共同作用4小时，并将合并放射性作为酸沉淀计数进行测量。CHX作为对照。(B类)HSF用CHX预孵育30分钟，然后用CCN1处理4小时，有或没有TNFα。DAPI染色后计数凋亡细胞。(C类)HSF与CCN1和/或TNFα孵育不同时间，细胞裂解物在SDS-PAGE上溶解，然后用NFκB-65的S536磷酸特异性抗体进行免疫印迹。去除印迹，并用抗总NFκB-65的抗体进行再验证。(D类)通过瞬时转染由NFκB反应序列（Takada等, 2004). 转染细胞用CCN1和/或TNFα处理指定时间，并测定细胞裂解液中的荧光素酶活性。对照转染效率控制标准化活性。(E类)HSF预先用细胞渗透性JNK抑制肽（50μM）或SP600125（25μM）孵育30分钟，然后用CCN1和/或TNFα处理4小时，然后进行凋亡评分。如有指示，在CCN1/TNFα治疗3小时后添加JNK抑制剂。(F类)如图所示，用CCN1和/或TNFα处理HSF不同时间（10分钟至8小时），并用抗双磷酸化JNK1/2的抗体（T183/Y185）电泳和免疫印迹细胞裂解物。去除印迹，并用识别总JNK1/2的抗体进行再验证。(G公司)细胞预先用10 mM NAC或0.4 mM BHA孵育30 min，然后用CCN1和/或TNFα处理4 h，然后进行凋亡评分。(H（H）)用Nox1-siRNA转染细胞48小时以下调Nox1，或用Rac1抑制剂NSC23766（0.4mM）、MK886（10μM）或鱼藤酮（10μM）预孵育30分钟，然后用CCN1/TNFα处理15分钟或5小时（更多细节见图5）。细胞裂解物在SDS-PAGE上溶解，并用双重磷酸化和总JNK1/2抗体进行免疫印迹。
图4
图4
CCN1通过其凋亡受体诱导ROS。HSF在玻璃盖片上培养，并与CCN1和/或TNFα孵育，然后在加载H后通过荧光显微镜检测ROS2DCF-DA（PBS中为5μM）。每个样品拍摄十个随机选择的高功率场，每个细胞的平均荧光强度以任意单位表示。(A类)用CCN1和/或TNFα处理细胞不同时间。(B类)在用CCN1治疗2小时之前，用50μg/ml的以下抗体预先培养细胞（30分钟），并如上所述检测ROS积累：P1F6（抗αv（v）β5)，LM609（抗αv（v）β三)，GoH3（抗α6)、兔多克隆抗yndecan-4抗体和正常IgG作为对照。(C类)用野生型CCN1、DM、TM、D125A或DM和D125A的组合处理细胞2小时。
图5
图5
CCN1和TNFα通过不同的细胞来源诱导ROS积累，以及ROS对细胞凋亡的需求。用对照siRNA（四个无关序列的混合物）、Rac1 siRNA或Nox1 siRNA转染HSF，或用5-脂氧合酶抑制剂MK886（10μM）或线粒体复合物I抑制剂鱼藤酮（10μM）预处理HSF。然后，在ROS检测前用CCN1、CHX和/或TNFα孵育细胞1小时，或在凋亡检测前4.5小时。siRNAs和抑制剂对活性氧累积的影响(A类,C类)和凋亡(B类,D类)如图所示。用抗Rac1和β-肌动蛋白抗体免疫印迹总细胞裂解物显示Rac1与Nox1 siRNA在转染细胞中的作用(E类)或通过RNA印迹探测32P标记的人类Nox1（显示2.0 kb Nox1 mRNA）和GAPDH cDNA(F类).
图6
图6
的生成通讯录1分/分小鼠和钝性TNFα介导的细胞凋亡体内. (A类)基因靶向结构取代了生态RI–圣诞节的I片段通讯录1带有cDNA编码通讯录1糖尿病.重组等位基因维持了通讯录1启动子和转录起始位点并表达通讯录1糖尿病保留5′和3′非翻译序列的cDNA。胸苷激酶（tk）和PGK-新作为ES细胞同源重组的选择性标记。B、，巴姆你好；X、，圣诞节我；R、，生态RI；S、，速度一、(B类)从野生型（WT）或通讯录1dm/Ccn1型小鼠（+/-）用速度我用一个巴姆HI（高）/生态RI片段，产生6.3（野生型）和5.7（靶向）kb条带，如（A）所示。(C类)从MEF中分离出总RNA，逆转录和通讯录1PCR扩增序列。这个通讯录1糖尿病cDNA包含工程诊断速度1个位点，在野生型序列中不存在。(D类)MEF来自通讯录1分/分对小鼠及其野生型同窝小鼠进行血清刺激，诱导CCN1的合成，同时标记35S-半胱氨酸。总细胞裂解物通过肝素-葡萄糖柱，并用含有不同浓度NaCl的缓冲液洗脱，如图所示。用抗CCN1抗体免疫沉淀洗脱的蛋白质，在SDS-PAGE上溶解并暴露于X射线胶片。(E类)尾静脉注射ConA（20 mg/kg体重），8 h后用TUNEL分析（罗丹明标记）分析肝细胞凋亡。在三个随机选择的字段中计算凋亡细胞的数量，并表示为cells/1mm2组织。（重量，n个=5;通讯录1分/分,n个=8;*P（P）<0.001). 组织切片如所示(F类). (G公司)皮下注射TNFα（每50μl 400 ng）可诱导细胞凋亡。8小时后，收集、处理注射部位的皮肤组织，并进行TUNEL分析。凋亡细胞数如上所示。（重量，n个=4;通讯录1分/分,n个=7;*P（P）<0.001). 组织切片如所示(H（H）)，放大倍数较高的视图如所示(J型). (我)ConA或PBS处理的WT或通讯录1分/分用抗8-OHdG抗体对小鼠进行染色。
图7
图7
CCN1/TNFα协同作用模型。通过CCN1的基质信号可以覆盖NFκB的抗凋亡作用，使TNFα诱导凋亡（图1、2和3）。本文提供的数据支持CCN1与其受体（整合素α）结合的模型v（v）β5, α6β1和syndecan-4）导致依赖Rac1、5-脂氧合酶和线粒体的ROS积累增加和延长，导致在TNFα存在下JNK的双相激活（图3、4和5）。其他研究表明，活性氧可灭活磷酸酶（Kamata等，2005），导致JNK持续激活，进而触发c-FLIP的降解（Chang等（Micheau和Tschopp，2003），以允许TNFα依赖的细胞质复合体II激活caspases-8。通过Bax介导的细胞色素通过线粒体扩增caspases-8/10信号c（c）caspase-9和-3的释放和激活，导致细胞凋亡。
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