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。2007年4月；87(4):326-35.
doi:10.1038/lipinvest.3700523。 Epub 2006年2月19日。

转基因心脏靶向人类突变聚合酶γ降低mtDNA、氧化应激、心肌病和死亡

威廉·刘易斯 1, 布莱恩·戴伊, 詹姆斯·科勒, 赛义德·侯赛尼, 雪琳·S·L·陈, 埃尔金·C·格林, 乍得帕斯, 艾琳·S·基博, 罗伯特·朗, 托米卡·卢达韦, 罗德尼·罗斯, 杰弗里·斯特策, 尼娜·蒂奥列科, 罗伯特·桑托安尼, 威廉·科普兰
附属公司

转基因心脏靶向人类突变聚合酶γ减少线粒体DNA、氧化应激、心肌病和死亡

威廉·刘易斯等。 实验室投资。 2007年4月。

摘要

POLG是编码DNA聚合酶γ（Polγ）催化亚单位的人类基因，Polγ是人类线粒体DNA（mtDNA）的复制酶。POLG Y955C点突变导致人类慢性进行性外眼肌麻痹（CPEO），这是一种伴有眼肌无力和线粒体DNA缺陷的线粒体疾病。Y955C POLG转基因靶向小鼠心脏。在四个甘油三酯（+/-）品系和野生型（WT）窝友（-/-）中测定存活率。左心室（LV）表现（超声心动图和MRI）、心率（心电图）、线粒体DNA丰度（实时PCR）、线粒体dna氧化（8-OHdG）、组织病理学和电镜确定了表型。心脏靶向Y955C POLG在患有心肌病（CM）、线粒体氧化应激和过早死亡的心脏中产生了CPEO的分子特征。左室腔大小和重量增加、心动过缓、线粒体DNA减少、8-OHdG增加、心脏组织病理学和线粒体EM缺陷支持并定义了表型。本研究强调了人类突变POLG及其基因产物在线粒体DNA缺失、线粒体氧化应激和CM中的致病作用，因为它与CPEO的遗传缺陷有关。转基因模型在病理生理学上将人类突变Polγ、线粒体DNA缺失和线粒体氧化应激与线粒体DNA复制装置和CM联系起来。

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数字

图1
图1
Y955C TG Polγ蛋白表达和基因拷贝剂量：在4–12%聚丙烯酰胺凝胶上分离纯化的TG和对照心脏线粒体裂解物中的蛋白，然后转移到Immobilon-P进行Western blot分析或考马斯蓝染色。A） 心脏线粒体提取物的Western blot分析。通道1、纯化的重组人Polγ作为对照，通道2、通道4和通道6分别来自33、25和10周龄小鼠Y955C TG心脏的线粒体裂解物。第3、5和7道分别是33、25和10周龄小鼠对照TG阴性心脏的线粒体裂解物。箭头表示polγ。B） 考马斯蓝染色凝胶证明心脏线粒体蛋白的等效部分通过Western blot分析。通道1-7与面板A中的相同，不同之处在于，在凝胶中装载并分离了5倍于蛋白质量的蛋白质，以通过考马斯蓝染色进行检测。C.从产生的4个品系的心脏组织中测定突变体Y955C-Polγ的相对基因拷贝数。箭头表示polγ。C） 从产生的4个品系的心脏组织中测定了人类突变体Y955C-Polγ的相对基因拷贝数。的级别POLG公司使用实时PCR和Light Cycler TaqMan Master试剂盒对小鼠尾部DNA提取物进行半定量分析，并将其归一化为WT的GAPDH。
图2
图2
Y955C TG的Kaplan-Meier生存曲线和组织病理学评估：A）不同TG系的生存率存在差异。D线的中位生存期为90天，C线为210天，E线为>420天，B线为>600天，与WT.B最相似。组织病理学（Masson’s三色染色）与D线的死亡相关：对D线21天大的TG进行尸检。胸部半切显示巨大心房增大（A），提示心力衰竭（箭头）以及压迫肺部（L）。
图3
图3
采用实时PCR技术分析WT和Y955C TG小鼠线粒体提取物中实时PCR mtDNA/nDNA比值和2dG和8-OHdG的稳态丰度：A）WT和TG队列的心脏样本（N≥8）。Y955C-PolγTG（C系）发现mtDNA/nDNA比率降低（*p<0.01）。B） 根据标准方法分离线粒体并提取线粒体DNA。核苷酸丰度表示为8-OHdG与2dG x10的平均摩尔比和平均值（SEM）的标准误差−5Y955C心脏中8-OHdG的稳态丰度是WT的3倍（p<0.05），（N=6）。
图4
图4
Y955C-PolγTG的ECHO图像定量分析：以盲法计算LV质量，打破代码，并将120天Y955C PolγTG线的数据制成表格。将数据标准化为体重（mg/g），并绘制为平均值±SEM。120天时，C线和D线存活。他们的心脏重量比WT增加了>100%（*p<0.01）。
图5
图5
TG和WT心脏的MRI：使用上述方法对小鼠心脏进行MRI成像。9个月大时TG Y955C（左）和WT室友（右）的四腔扩大。TG显示心脏四腔扩大，同时右心室（开放箭头）和左心室（填充箭头）扩大。
图6
图6
Y955C-PolγTGs心脏和线粒体的组织病理学（A、B）和EM（C）图像：使用表达Y955C TG或WT对照的性别匹配的同窝婴儿。TG在心脏过度表达导致心肌病伴双心室肥厚和心脏肥大。箭头指向粒度增加的裂解变化。（Y955C:A，原始放大倍数为1X，B，原始放大倍率为600 X）。组织病理学结果（苏木精和伊红染色）由EM（C，EM原始放大倍数：26000）观察到的线粒体损伤和增大支持。标记为1μ）。
图7
图7
Y955C-Polγ在小鼠模型中作用的示意性总结。Polγ突变体Y955C的心脏靶向性过表达导致线粒体DNA生物发生改变，导致心脏功能障碍，最终导致过早死亡。证明存在天然Polγ和过度表达Y955C突变体。
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  • 聚合酶γ突变心脏中的mt-tRNAs。
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