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.2007年4月；18(4):1421-9.
doi:10.1091/mbc.e06-09-0780。 Epub 2007年2月7日。

Prox1通过整合素α9和其他信号级联诱导淋巴管内皮分化

三岛光一 1, 水井裕久, 斋藤昭, 吉松康弘, Natsuko Imaizumi公司, Shinji Masui公司, Masanori Hirashima公司, 托鲁·莫里萨达, 小池裕一, Makoto Araie公司, Niwa Hitoshi Niwa, Hajime Kubo先生, Toshio Suda公司, Kohei Miyazono先生
附属公司

Prox1通过整合素α9和其他信号级联诱导淋巴管内皮分化

三岛光一等。 分子生物学细胞. 2007年4月.

摘要

在胚胎淋巴发育过程中，同源盒转录因子Prox1在血管内皮细胞亚群向VEGF-C表达细胞的萌发和迁移中起着重要作用。然而，Prox1对内皮细胞行为的影响仍有待阐明。在这里，我们表明Prox1通过诱导整合素α9的表达，抑制片状形成并刺激内皮细胞的运动。Prox1表达的BEC通过上调整合素α9和VEGF受体3（VEGFR3）的表达优先向VEGF-C迁移。在小鼠胚胎中，与BECs相比，表达Prox1的淋巴管内皮细胞（LECs）中VEGFR3和整合素α9的表达增加。敲低人LECs中Prox1的表达导致整合素α9和VEGFR3的表达降低，导致对VEGF-C的化学反应性降低。这些发现表明，Prox1通过调节多个信号级联在赋予和维持LECs特性方面发挥着重要作用，整合素α9可能是Prox1下游淋巴管生成的关键调节因子。

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数字

图1。
图1。
Tc调节的Prox1表达对ESC衍生EC和HUVEC的形态和片状形成的影响。（A） Flk1+内皮祖细胞从分化的ESC中分离出来，ESC携带Tc调节的转基因编码FLAG表位标记的小鼠Prox1（Tc-Prox1）或对照转基因（Tc-Empty），并在有（+）或无（-）Tc的情况下进行再分化，以获得PECAM-1阳性的EC（底部，红色）和平滑肌α-肌动蛋白（SMA）-阳性壁细胞（底部，绿色）。检测FLAG-Prox1（顶部，蓝色）的表达以及内皮细胞（底部，红色）的形态和片状形成。比例尺，100μm。（B） 菌落形成、EC和壁细胞生成以及内皮层形成的定量。将来自Tc-Prox1 ESCs的Flk1+细胞与10%胎牛血清在无Tc或有Tc的情况下稀疏培养4 d，并对PECAM1（红色）和SMA（绿色）进行染色。计算每孔不同类型的菌落数，以确定Prox1对Flk1+细胞菌落形成的影响。观察到四种菌落类型：纯内皮细胞形成片状结构（内皮细胞片状，红色）；纯散射EC（EC散射，粉红色）；纯壁细胞（MC，绿色）；以及由内皮细胞和壁细胞组成的混合菌落（Mix，黄色）。实验重复至少三次，结果基本相同。棒材，50μm。（C） 感染编码LacZ、DNA-结合突变体（Mut）或野生型（WT）Prox1的腺病毒的HUVEC的形态学。棒材，100μm。
图2。
图2。
Prox1对ESC衍生EC和HUVEC迁移的影响。细胞迁移通过视频延时显微镜进行测量，如材料和方法。（A） 对来自Tc-Prox1 ESCs的EC进行24小时的视频显微镜检查（补充视频1和2）。（B） HUVEC感染编码DNA-结合突变体（Mut）或野生型（WT）Prox1的腺病毒（Ad），并进行24小时的视频显微镜检查（补充视频3和4）。结果表示为24小时内的综合细胞运动性。每个值代表10次测定的平均值；巴，标准偏差。
图3。
图3。
整合素α9在HUVEC迁移中的作用。（A和B）通过定量实时PCR分析，在ESC衍生的EC（A）和HUVEC（B）中测定整合素α9转录物的表达。（C和D）HUVEC感染编码DNA-结合突变体（Mut）或野生型（WT）Prox1的腺病毒，并在存在对照IgG或抗整合素α9（intα9）中和抗体的情况下进行24小时的视频显微镜检查。显示了HUVEC（C）和综合细胞运动（D）的最终图像。棒材，100μm。每个值代表10次测定的平均值；巴，SD（E）通过Boyden室测定法测量细胞迁移。HUVEC感染编码DNA-结合突变体（Mut）或野生型（WT）的腺病毒（Ad），并在Boyden培养箱上放置对照IgG或抗整合素α9（intα9）-中和抗体，VEGF-C放置在下孔中。结果表示为迁移细胞数量与对照组（无引诱剂）的比例。每个值代表三次测定的平均值；巴，标准偏差。
图4。
图4。
Prox1对VEGF-A和VEGF-C刺激的HUVEC迁移的影响。如材料和方法。HUVEC感染了编码DNA-结合突变体（Mut）或野生型（WT）Prox1的腺病毒（Ad），以及编码VEGFR3野生型（WT）、显性阴性突变体形式（d.n.Mut）、或Null（不编码转录物）的腺病毒，并将指示的化学引诱剂放置在Boyden培养箱的下孔中。使用Ad-Null对所有样本用相同数量的腺病毒感染HUVEC。结果表示为迁移细胞数量与对照组（无引诱剂）的比值。每个值代表三次测定的平均值；巴，标准偏差。
图5。
图5。
BEC和LEC标记在小鼠胚胎Prox1-expressing LECs中的表达。解剖E14小鼠胚胎，切除胚胎肝脏和脾脏。分离其他组织，并用抗CD45、LYVE1（ALY7）、CD31和CD34抗体进行FACS分类（参见材料和方法). CD45−；CD31+；CD34+；LYVE1−BEC组分和CD45−；CD31+；CD34−；通过实时定量PCR分析LYVE1+LEC组分中LYVE1（A）、Prox1（B）、VEGFR3（C）和整合素α9（D）转录物的表达。每个值代表三次测定的平均值；巴，标准偏差。
图6。
图6。
内源性Prox1在HDLECs中的作用。（A） 用HUVECs（顶部）和HDLECs（底部）中的特异性抗体检测内源性Prox1（左侧；绿色）的表达，并用碘化丙啶（PI，中间；红色；右侧，合并）对细胞核进行反染。棒材，100μm。（B–E）通过实时定量PCR分析检测Prox1敲低对GAPDH（B）、Prox1（C）、VEGFR3（D）和整合素α9（E）表达的影响。一个加扰的siRNA序列（Ambion）被用作阴性对照siRNA（siNTC）。每个值代表三次测定的平均值；bars，SD。（F）Prox1基因敲除对HDLECs对VEGF-A（50 ng/ml）和VEGF-C（50 ng/ml）的趋化性的影响。通过Boyden小室试验测量细胞迁移，如材料和方法。用干扰siRNAs（siNTC）或Prox1-siRNAs转染HDLECs，并将其放置在Boyden培养箱上，将指定的化学引诱剂放置在较低的培养箱中。结果表示为迁移细胞数量与对照组（无引诱剂）的比值。每个值代表三次测定的平均值；巴，标准偏差。
图7。
图7。
Prox1在血管内皮细胞（BEC）向淋巴管内皮祖细胞（LEPC）分化过程中的作用示意图。详见正文。
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