Acute postnatal ablation of Hif-2alpha results in anemia

doi:10.1073/pnas.0608382104

.2007年2月13日；104(7):2301-6.

doi:10.1073/pnas.0608382104。 Epub 2007年2月6日。

出生后急性消融Hif-2alpha导致贫血

迈克拉·格鲁伯¹, 胡成军, 兰德尔·S·约翰逊, 埃里克·J·布朗, 布莱恩·基思, M Celeste Simon先生

附属公司

PMID： 17284606
预防性维修识别码：项目经理1892942
内政部： 10.1073/pnas.0608382104

出生后急性消融Hif-2alpha导致贫血

迈克拉·格鲁伯等。美国国家科学院程序. 2007.

.2007年2月13日；104(7):2301-6.

doi:10.1073/pnas.0608382104。 Epub 2007年2月6日。

作者

迈克拉·格鲁伯¹, 胡成军, 兰德尔·S·约翰逊, 埃里克·J·布朗, 布莱恩·基思, M Celeste Simon先生

附属

¹美国宾夕法尼亚大学医学院艾布拉姆森家族癌症研究所，费城，宾夕法尼亚州19104。

PMID： 17284606
预防性维修识别码：项目经理1892942
内政部： 10.1073/pnas.0608382104

摘要

缺氧诱导因子（HIFs）介导对缺氧（缺氧）的适应性转录反应，HIFs是由两种碱性螺旋-环-螺旋PAS家族蛋白组成的异二聚体转录因子。HIF的转录活性由HIF-α蛋白的低氧稳定性决定。HIF-1α和HIF-2α表现出高序列同源性，但具有不同的mRNA表达模式；HIF-1α普遍表达，而HIF-2α的表达更局限于某些组织，例如内皮、肺、脑和神经嵴衍生物。任一HIF亚单位的种系缺失都是胚胎致死性的，其独特的特征表明HIF-α亚型都具有重要作用。Hif-2α的整体缺失导致不同的表型，这取决于用于突变的小鼠株，清楚地证明了Hif-2α在小鼠发育中的重要作用。然而，HIF-2alpha在成人生活中的作用尚不完全清楚。在本研究中，我们描述了条件性小鼠Hif-2alpha等位基因的产生及其出生后急性消融的影响。在非常严格的条件下，我们在出生后清除Hif-2alpha，并比较Hif-2alpha和Hif-1alpha急性全缺失的效果。我们的结果表明HIF-2alpha在成人红细胞生成中起着关键作用，急性缺失会导致贫血。此外，尽管HIF-1alpha是根据其对人类促红细胞生成素（EPO）3'增强子缺氧反应元件（HRE）的亲和力首次纯化和克隆的，并在小鼠胚胎发育期间调节EPO的表达，但HIF-2alpha却是调节成人生理和应激条件下EPO表达的关键α亚型。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
生成条件*Hif-2型*α等位基因。(一)靶向载体和重组步骤示意图。(B类)Cre激活的幼鼠的PCR基因分型。1–3车道秀*Hif-2型*α^{飞行/飞行}没有的老鼠*Cre公司*表达式。车道4*显示*Hif-2型*α^{佛罗里达州/Δ}没有Cre表达的动物。5–7道中的样本代表携带Cre转基因小鼠的DNA，并显示缺失*Hif-2型*α. (C类)Cre阴性和阳性动物肾脏（1、4、7道）、肝脏（2、5、8道）和肺（3、6、9道）分离的DNA的Southern blot分析。(D类)六种不同动物肾脏和肝脏cDNA的RT-PCR分析。第1和第7道显示，漂浮的mRNA转录物仍含有外显子2（650 bp）。通道2*、3*、8*和9*同时表达漂浮和缺失的外显子2 mRNA和背景带。耗尽*Hif-2型*α导致外显子2完全缺失，如第4-6和10-12车道所示（450 bp）。(E类)ROSA26报告小鼠Cre激活后β-半乳糖苷酶的表达。

**图2。**
*Hif-2型*α^Δ/Δ小鼠贫血。(一–C类)红细胞总数(一)，血红蛋白浓度(B类)和红细胞压积水平(C类)在小鼠体内分别减少25%、32%和30%*Hif-2型*α外显子2缺失。中度缺失只会导致8%（RBC）、14%（血红蛋白）和10%（红细胞压积水平）的下降*Hif-2型*α外显子2缺失与*Hif-2型*α^{佛罗里达州/Δ}水平。(D类)Cre激活后2周从耳孔中分离的DNA的PCR分析。车道1-7对Cre为负值，因此fl/wt（车道2、6和7）或fl/Δ（车道1和3-5）。通道8–16对Cre转基因呈阳性，根据PCR，已经损失了90–100%*Hif-2型*α表达（车道8–10和13）或≈75%*Hif-2型*α（车道12、14和15），或显示出非常弱的环路，在这种情况下，动物类似于*Hif-2型*α杂合子（第11和16车道）。(E类)出生后第一周内Cre的激活导致一致的高删除效率，并导致旋转红细胞压积值下降32%。(F类)展示的老鼠*Hif-1型*α缺失不能导致贫血。(*G公司*)Hif-1α的环路输出效率。

**图3。**
红系祖细胞减少*Hif-2型*α^Δ/Δ骨髓却在脾脏中增加。(一)*Hif-2型*α^Δ/Δ骨髓祖细胞在甲基纤维素中形成的红细胞集落少于*Hif-2型*α^{佛罗里达州/Δ}单元格do(n个= 4). (B类)相比之下，*Hif-2型*α^Δ/Δ脾祖细胞形成红细胞集落的可能性高于来自*Hif-2型*α^{佛罗里达州/Δ}脾脏(n个= 4). (C类)由以下因素形成的非红细胞集落数量差异不大*Hif-2型*α^{佛罗里达州/Δ}和*Hif-2型*α^Δ/Δ骨髓细胞(n个= 4). (D类)Ter119的百分比^高的/CD71型^高的红系祖细胞减少*Hif-2型*α^Δ/Δ骨髓，但在*Hif-2型*α^Δ/Δ脾脏(n个= 3). (E类)具有代表性的FACS印迹*Hif-2型*α^{佛罗里达州/Δ}和*Hif-2型*α^Δ/Δ骨髓和脾脏Ter119和CD71染色。

**图4。**
*Epo公司*应激诱导红细胞生成后的表达依赖于HIF-2α。(一)未经治疗和经治疗的PH的脾脏与体重的比值*Hif-2型*α^{佛罗里达州/Δ}和*Hif-2型*α^Δ/Δ老鼠。(B类)PH处理后的血清EPO水平*Hif-2型*α*佛罗里达州*/*佛罗里达州*,*佛罗里达州*/Δ和Δ/Δ小鼠。(C类)*Hif-1型*α*佛罗里达州*/*佛罗里达州*经PH处理后，Δ/Δ小鼠的EPO刺激没有任何缺陷。(D类)红细胞压积值增加*Hif-2型*α^{佛罗里达州/Δ}和*Hif-2型*α^Δ/Δ动物，因为EPO治疗，并在2周后达到正常水平*Hif-2型*α^Δ/Δ老鼠。

**图5。**
体外HIF-1α和HIF-2α诱导的能力分析*欧洲专利局*mRNA转录。(一)siRNA敲除*HIF-1型*α和*HIF-2型*α. HIF-1α和HIF-2α的Western blot显示在缺氧（H）条件下蛋白稳定，siRNA转染后相应蛋白的特异性丢失。(B类)*欧洲专利局*Hep3B细胞中的mRNA水平。缺氧条件下mRNA与正常细胞相比的折叠变化。未转染细胞和转染对照siRNA的细胞显示出55倍的诱导*欧洲专利局*mRNA在缺氧条件下表达。击倒*HIF-1型*α导致*欧洲专利局*mRNA。相反，siRNA对抗*HIF-2型*α导致了5倍的诱导和击倒*低氧诱导因子*几乎完全消融*欧洲专利局*缺氧条件下的mRNA诱导。(C类)一种突变的（“TM”）因而稳定的HIF-1α和HIF-2α以越来越高的浓度引入Hep3B细胞，导致强烈的诱导*欧洲专利局*HIF-1αmRNA和HIF-2α诱导作用不太显著。(D类)蛋白质印迹显示过表达蛋白的水平。

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