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比较研究
.2007年2月7日；26(3):825-34.
doi:10.1038/sj.emboj.7601533。 Epub 2007年1月18日。

Bak和Bax在感染和DNA损伤诱导的凋亡过程中是非冗余的

奥利弗·凯普 1, 克里希纳拉·拉贾林加姆, 索尼娅·基米格, 托马斯·鲁得尔
附属公司
比较研究

Bak和Bax在感染和DNA损伤诱导的凋亡过程中是非冗余的

奥利弗·凯普等人。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

线粒体外膜通透性（MOMP）和线粒体膜间蛋白（如细胞色素c）的释放是细胞凋亡控制的关键步骤。先前的研究表明，MOMP依赖于功能冗余的多域促凋亡蛋白Bak和Bax。这里我们证明，在淋病奈瑟菌（Ngo）和顺铂诱导的凋亡过程中，Bak和Bax在功能上是非冗余的。Bak的激活是caspase非依赖性的，Bax的激活需要Bak和活性caspase。Bak或Bax的沉默可以抵抗Ngo和顺铂，但不能抵抗TNFalpha诱导的凋亡。激活Bak是从线粒体释放细胞色素c所必需的；然而，Bax仍然需要激活效应器半胱天冬酶。因此，Bak和Bax都是完成DNA损伤和Ngo诱导的凋亡所必需的。

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数字

图1
图1
线粒体膜电位（MMP）和细胞色素损失c（c）释放期间Ngo公司感染与caspase激活无关。(A类)使用亚G法进行FACS分析，测量在有或无广谱caspase抑制剂zVAD的情况下感染的HeLa细胞的DNA片段。以TNFα/CHX为对照。(B类)此外，通过FACS分析使用TMRE染色测量MMP的损失。用原核CCCP处理的细胞作为对照。(C类)可视化MMP-loss和细胞色素c（c）释放-Ngo公司-感染细胞用MitoTracker橙色抗细胞色素染色c（c）抗体。显示了叠加和相应的相位对比度图像。尺寸条代表10μm。(D类)线粒体显示MMP丢失和细胞色素的细胞c（c）使用共焦显微镜定量释放。每个样本至少有150个细胞是从代表性实验中计数的。(E类)细胞色素的数量c（c）在非感染（对照）、感染（Ngo）和感染zVAD治疗（Ngo+zVAD）细胞中监测释放到胞浆的情况。释放的细胞色素c（c）使用抗细胞色素进行可视化c（c）抗体和抗β-actin抗体作为负荷对照。使用抗Cox II抗体检查胞质溶胶的纯度。(F类)释放的细胞色素的相对量c（c）通过密度分析定量。为了确定zVAD的效果，将预处理的未感染样本设置为空白，并将感染细胞的胞浆设置为100%。面板（A）、（B）和（F）显示了三个独立实验的数据，误差条表示平均值的±s.d。
图2
图2
在Ngo和顺铂诱导的细胞凋亡过程中，激活Bax而非Bak需要活性caspase。感染Ngo的HeLa细胞进行活性Bak染色(A类)和活性Bax(B类)使用构象特异性抗体并通过FACS分析进行量化。(C类)在免疫沉淀实验中使用相同的抗体监测感染期间Bax和Bak的激活以及顺铂诱导的细胞凋亡。TNFα/CHX诱导细胞凋亡作为阳性对照。用zVAD预处理细胞可阻断Bax，但在感染和顺铂诱导时不能阻断Bak的激活。(D类)细胞色素的释放c（c）亚细胞分离分析。在有或无zVAD的情况下，用顺铂诱导HeLa细胞凋亡20 h，并按照材料和方法中所述制备亚细胞组分。细胞色素水平c（c）用免疫印迹法对不同组分进行分析。通过线粒体标记蛋白Cox II的存在来监测组分的纯度。
图3
图3
Ngo和顺铂诱导Bax活化需要Bak。为了进一步分析，使用RNAi沉默Bak和Bax。(A类)使用siRNAs对Bax、Bak或Bax和Bak进行短暂击倒。转染后，通过免疫印迹分析监测基因沉默的效率。(B–C类)通过产生稳定表达针对Bak（shBak）或Bax（shBax）mRNA的shRNA的细胞系，使Bak或Bax的表达永久沉默。通过免疫印迹验证敲除。(D类)用Ngo感染转染了针对Bak的siRNA的细胞8小时，并通过免疫沉淀活性Bax监测Bax的激活，如前所示。在Bak缺乏细胞中未检测到Bax激活。(E–F)同时，顺铂治疗后监测Bak-对Bax活化的依赖性。一贯地，Bax活化被siRNA和shRNA介导的Bak敲除所抑制，而TNFα治疗在相同条件下仍然激活Bax。
图4
图4
Ngo和顺铂诱导的细胞凋亡需要Bax和Bak。(A类)Bak或Bax缺陷细胞感染Ngo，通过TUNEL分析定量凋亡。(B类)此外，使用CaspAce测定试剂盒通过FACS分析测量效应半胱天冬酶活性。(C类)通过使用裂解的胱天蛋白酶-3抗体检测p19/17片段的出现来监测Ngo感染时效应胱天蛋白酶-3的激活。一贯地，Bak而非Bax敲除完全消除了效应器caspase激活，从而在Ngo感染时发生凋亡。(D类)通过Hoechst 33342染色和碎核计数测量顺铂诱导的凋亡显示出对Bak的明显依赖性，对Bax的依赖性较小。TNFα可诱导不依赖于Bak和Bax的细胞凋亡，作为对照。(E类)此外，如前所述测量效应器半胱天冬酶活性。至于Ngo感染，Bak的沉默抑制了顺铂治疗后效应半胱天冬酶的激活。（A） 、（B）和（D）显示了三个独立实验的数据，误差条表示平均值的±s.D。
图5
图5
细胞色素的Bak依赖性释放c（c）Ngo和顺铂诱导的细胞凋亡期间。(A类)永久表达shBak或shBax的HeLa细胞被感染，细胞色素c（c）用抗细胞色素免疫荧光法观察感染后的释放c（c）抗体。GFP表达源自用于shRNA转录的载体。(B类)顺铂诱导的细胞色素c（c）通过用抗细胞色素共同染色细胞来监测释放c（c）抗体和Hoechst 33342。箭头表示细胞释放细胞色素c（c）. (C–D)此外，细胞色素的释放c（c）通过使用抗细胞色素来监测感染和顺铂治疗后shBak和shBax细胞c（c）亚细胞分离后胞液提取物中的抗体。ShBak细胞未释放细胞色素c（c）而shBax和对照组释放细胞色素c（c）顺铂治疗或Ngo感染。
图6
图6
激活Bax需要Caspase-9。(A类)使用siRNA沉默感染或非感染细胞中Caspase-9的表达，如图所示沉淀活性Bak或Bax。使用抗痉挛-9抗体验证caspase-9的敲除。通过使用抗-Bak-NT和抗-Bax-NT抗体对细胞裂解产物进行额外分析，排除了caspase-9敲除对Bak和Bax表达水平的影响。(B类)用caspase-9抑制剂LEHD-fmk预处理感染细胞和未感染细胞，如图所示沉淀活性Bax和Bak。(C类)如前所述，分析了caspase-9敲除对顺铂治疗中Bax活化的影响。感染和顺铂治疗后Bax的激活依赖于caspase-9。(D类,E类)Apaf-1是激活Bax所必需的。如图所示，Apaf-1的表达被siRNAs沉默，活性Bax和Bak被免疫沉淀。
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