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.2007年2月；27（4）：1407-24。
doi:10.1128/MCB.00944-06。 Epub 2006年12月4日。

组蛋白甲基转移酶G9a和其他染色质修饰酶在SHP介导的肝胆汁酸代谢调节中的协同募集

宋松芳 1, 吉苗, 玲珑香, 巴斯卡尔·波努戈蒂, 埃卡特·特雷特, 琼索克·金·坎佩尔
附属公司

组蛋白甲基转移酶G9a和其他染色质修饰酶在SHP介导的肝胆汁酸代谢调节中的协同募集

宋松芳等。 分子细胞生物学. 2007年2月.

摘要

SHP具有抑制多种核受体的能力，被认为是多种生物功能的多效性调节因子。最近，我们报道了SHP通过招募组蛋白脱乙酰酶（HDAC）和Swi/Snf-Brm复合物抑制胆汁酸生物合成关键基因CYP7A1的转录。为了进一步阐明这种抑制的机制，我们检查了组蛋白甲基化是否也参与其中，以及染色质修饰酶之间是否发生功能性相互作用。组蛋白甲基转移酶G9a（而不是SUV39）在细胞核中与SHP共定位，并在体外与SHP直接相互作用。与肝SHP共免疫沉淀的G9a在体外甲基化组蛋白3（H3K9）的Lys-9。G9a的表达增强了SHP对CYP7A1转录的抑制，而一个催化失活的G9a显性阴性（DN）突变体逆转了SHP的抑制。在胆汁酸处理的HepG2细胞中，G9a被招募到CYP7A1启动子处，H3K9以SHP依赖性方式甲基化。G9a-DN突变体的表达抑制H3K9甲基化，阻止Brm复合体的募集，并部分逆转胆汁酸对CYP7A1的抑制。曲古抑菌素A抑制HDAC活性可阻断启动子处H3K9的脱乙酰化和甲基化，相反，G9a-DN抑制H3K9甲基化可部分阻断脱乙酰化。喂食胆酸的小鼠肝脏中G9a-DN的表达破坏了胆汁酸的体内平衡，导致胆汁酸池增加，Cyp7a1和Cyp8b1部分降低。我们的研究确立了G9a甲基转移酶、组蛋白脱乙酰化酶和Swi/Snf-Brm复合物在SHP介导的通过靶基因协调染色质修饰抑制肝胆汁酸合成中的关键作用。

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数字

图1。
图1。
G9a与小鼠肝脏和HepG2细胞中的SHP相关。（A和B）SHP和G9a（A），但不是SUV39H1（B），在细胞核内共定位。用GFP-SHP表达质粒DNA和G9a或HA-SUV39H1共同转染Cos-1细胞。如材料和方法所述，SHP用GFP荧光（绿色）检测，G9a和SUV39H1用罗丹明结合二级抗体（红色）免疫荧光检测。显示了G9a或SUV39H1免疫荧光的典型共焦显微图像、GFP-SHP的绿色荧光图像和合并图像。合并图像中的黄色区域表示G9a和SHP的共定位。（C） 从小鼠肝脏或HepG2细胞制备核提取物（NE），并与GST或GST-SHP孵育。GST蛋白与谷胱甘肽-Sepharose结合，洗涤后，通过SDS-PAGE和使用G9a抗体的Western blotting检测与GST蛋白相关的蛋白。图中显示了G9a的位置，左侧显示了分子量标记的位置。输入物含有结合反应中所用提取物量的10%。（D） 使用IgG作为对照或使用针对SHP或G9a的抗体（Ab）对从HepG2细胞制备的核提取物进行免疫沉淀，并且分别使用G9a或SHP抗体通过SDS-PAGE和Western印迹检测免疫沉淀中内源性G9a或SHP的结合。与C组相比，G9a的扩散谱带是由于样品中沉淀抗体的大量蛋白质导致的，这降低了谱带的分辨率。（E） SHP和全长（FL）GST-SHP和GST-SHP缺失突变体的示意图。RID和RD分别指受体相互作用域和内在抑制域。（F）35体外合成S-G9a，并按照材料和方法中的描述进行GST下拉分析。输入代表20%的35S标记的G9a用于结合反应。指示G9a的位置。（G） GST-G9a缺失突变体（残基621至1000）的示意图。SET表示通用的域苏(无功功率，无功功率),Zeste增强器、和三胸.（H）35合成S-SHP，并按照面板F所述进行GST下拉分析。输入代表20%的35反应中使用的S标记的SHP。
图2。
图2。
含SHP的配合物中的G9a体外甲基化H3K9。（A） ●●●●。将HepG2细胞或小鼠肝脏的核提取物（NE）与细菌表达、纯化的GST-SHP或与谷胱甘肽-脑葡萄糖结合的GST孵育。与GST-SHP或GST相关的蛋白质用作体外HMT试验中的酶源。蛋白质通过SDS-PAGE分离，然后进行凝胶考马斯染色（下面板）和放射自显影（上面板）。指出组蛋白H3和H4的位置。（B） 小鼠肝细胞核提取物（NE）与细菌表达、纯化的GST-SHP或与谷胱甘肽-脑葡萄糖结合的GST孵育。与Sepharose珠相关的蛋白质用作HMT分析中的酶源。反应后，用SDS-PAGE分离蛋白质，用二甲基化H3K9抗体进行Western blotting检测二甲基化的H3K9-组蛋白。分子质量标记的位置如左图所示。H3（二甲基H3K9）的位置显示在右侧。（C） HepG2核提取物用SHP抗体（Ab）或对照IgG免疫沉淀，免疫沉淀用作HMT试验的酶源。蛋白质通过SDS-PAGE分离，然后通过凝胶的考马斯染色检测分析中使用的核心组蛋白底物的数量（下面板），然后通过放射自显影检测三H标记组蛋白（上面板）。指出组蛋白H3和H4的位置。（D） 实验大纲。用对照空腺病毒载体（Ad-empty）或编码G9a-DN（Ad-G9a-DN）的腺病毒载体感染HepG2细胞，36 h后，对感染细胞进行半定量RT-PCR、Western blotting或免疫沉淀，然后进行体外HMT检测。（E） 以G9a抗体和HNF-4抗体作为对照，对细胞提取物进行Western blotting。（F） 细胞提取物用SHP抗体（Ab）或对照IgG免疫沉淀，免疫沉淀用作体外HMT试验中的酶源。如图所示，细菌表达和纯化的GST-H3（1-84）（WT）或其中K9突变为Arg的GST-H2突变体（H3R9）用作组蛋白底物。HMT反应样品的分析如面板A所述。
图3。
图3。
G9a增强SHP对CYP7A1转录的抑制作用。（A） 如图所示，用200 ng 5Gal4-TATA-luc、300 ng CMV-β-Gal、50 ng Gal4DBD（G4）或Gal4-HNF-4（G4HNF-4）、100 ng pcDNA3-PGC-1α和增加的pcDNA3-SHP和pEGFP-hG9a共同转染Cos-1细胞。（B） 用200 ng 5Gal4-TATA-luc、300 ng CMV-β-Gal、50 ng Gal4-HNF-4、50 ng pcDNA3-PGC-1、25 ng SHP共同转染Cos-1细胞，并增加pcDNA3-G9a或pcDNA3.1-SUV39H1的数量。（C） 如图所示，Cos-1细胞共转染200 ng 5Gal4-TATA-luc、300 ng CMV-β-Gal、10 ng Gal4-HNF-4、5 ng pcDNA3-PGC-1α、25 ng pcDNA-SHP和增加的pcDNA3-G9a。（D） Cos-1细胞共转染200 ng 5Gal4-TATA-luc、300 ng CMV-β-Gal、200 ng−1887-hCYP7A1-luc，50 ng CMV-HNF-4、25 ng pcDNA3-SHP，并增加pEGFP-G9a的数量，如图所示。在上述每种情况下，萤火虫荧光素酶活性的值均通过除以β-半乳糖苷酶活性进行标准化。通过三次测定计算平均值的标准误差。从两到四次独立的三份分析中获得了一致的结果。（E） 将稳定纳入基因组的−1887-hCYP7A1-luc报告质粒DNA的HepG2细胞感染Ad-G9a-DN或Ad-empty病毒，感染24 h后，用25或50μM CDCA或载体处理细胞10 h。通过除以总蛋白量来测定萤火虫荧光素酶活性并将其归一化。平均值的标准误差由三份样本计算得出，统计显著性由Student’st吨测试*，P（P）< 0.05; NS，统计学上不显著。（F） 用Ad-G9a-DN或Ad-empty病毒感染HepG2细胞，感染24 h后，用25μM CDCA或载体处理细胞10 h。分离总RNA并进行实时RT-PCR。CYP7A1 mRNA水平归一化为β-肌动蛋白mRNA水平，平均值的标准误差由三份样品计算得出。一名学生分析了CDCA处理样本中Ad空和Ad-G9a-DN感染样本之间的差异t吨测试*，P（P）< 0.05.
图4。
图4。
G9a被招募到内源性CYP7A1和CYP8B1启动子中，H3K9在喂食胆酸的小鼠和CDCA处理的HepG2细胞中甲基化。给小鼠喂食正常或添加0.5%胆酸（C.A.）的食物24小时，收集肝脏进行实时RT-PCR或ChIP分析。（A） 如材料和方法所述，从小鼠肝脏中分离出总RNA，并使用小鼠Cyp7a1、Cyp8b1和SHP以及36B4的特异性引物进行RT-PCR，作为对照。（B） 顶部显示了小鼠Cyp7a1、Cyp8b1和GAPDH基因的示意图，以及用于PCR的引物的位置。按照材料和方法中的描述分离和预处理可溶性染色质，并用抗SHP、G9a、二乙酰化H3 K9/K14或二甲基化H3K9的抗体或正常血清（NS）进行免疫沉淀。沉淀的染色质被广泛清洗。从沉淀前的输入染色质或沉淀的染色质中分离出基因组DNA，并使用Cyp7a1、Cyp8b1和GAPDH的特异引物集通过半定量PCR进行分析。（C） 使用Image J程序确定条带的强度。每个抗体沉淀的Cyp7a1启动子序列数量除以输入DNA样本中启动子序列的数量进行标准化，并将对照组中每个因子的值指定为100%。收集用50μM CDCA或载体二甲基亚砜在无血清培养基中处理18 h的（D至F）HepG2细胞，进行实时RT-PCR和ChIP分析。（D） 以人CYP7A1、SHP和36B4特异性引物为对照，分离总RNA并进行实时RT-PCR。（E） 在顶部，显示了人类CYP7A1基因的示意图和用于半定量PCR的CYP7A2特异引物集的位置。使用SHP、G9a、乙酰化组蛋白H3、二乙酰化H3 K9/K14或二甲基化H3K9抗体或正常血清（NS）进行ChIP分析。（F） 根据面板C所述的三个实验对结果进行量化和分析。对于面板A、C、D和F，平均值的标准误差由三倍计算得出，统计显著性由学生的t吨测试。公式图像,P（P）< 0.05;公式图像公式图像,P（P）< 0.01. 二-AcH3 K9/K14、二乙酰化的H3 K9/K14；二甲基化H3K9；人CYP7A1；mCyp7a1，小鼠Cyp7al1；mCyp8b1，小鼠Cyp8b1；mSHP，鼠标SHP；mGAPDH，鼠标GAPDH。
图5：。
图5：。
胆汁酸治疗后G9a向CYP7A1启动子的募集和随后的H3K9甲基化依赖于SHP的表达。用pSUPER或pSUPER-siSHP瞬时转染（A和B）HepG2细胞，并用50μM CDCA处理18 h。（A）通过实时RT-PCR测定相对于36B4 mRNA水平的mRNA水平。平均值的标准误差由三份样本计算得出，统计显著性由Student’st吨测试。公式图像公式图像,P（P）< 0.01. （B） 使用针对SHP和G9a的抗体进行ChIP测定。如图4E图例所示，对沉淀的染色质进行了广泛清洗和分析。（C） 用Ad-empty或Ad-siSHP病毒感染HepG2细胞，并用50μM CDCA或载体处理18 h。然后收集细胞，用SHP、G9a、二乙酰化H3K9/K14或二甲基化H3K 9抗体或正常血清（NS）进行ChIP分析。如图4E所示，对沉淀的染色质进行广泛洗涤和分析。二AcH3 K9/K14，二乙酰化H3 K8/K14；二甲基化H3K9；人CYP7A1；hGAPDH，人类GAPDH。
图6。
图6。
G9a-DN突变体的表达抑制H3K9去乙酰化和甲基化，并阻止Swi/Snf-Brm复合物向CDCA处理的HepG2细胞中的CYP7A1启动子的募集。HepG2细胞被Ad-G9a-DN或Adempty病毒多次感染10次，感染24 h后用50μM CDCA或载体处理18 h。（a）实时PCR检测CYP7A1的mRNA水平。（B和D）使用针对二甲基化H3K9或二乙酰化H3K9/K14的抗体、针对Brm、BAF170、mSin3A、HDAC-1、HDAC-2、NcoR1或HDAC-3的抗体以及图4E图例中所述的正常血清（NS）对感染细胞进行免疫沉淀。沉淀的染色质被广泛清洗，分离的DNA使用人类CYP7A1特异引物集通过半定量PCR进行分析，如图4E图例所示。（C和E）使用Image J程序测定了三个独立实验中的谱带强度，并按照图4C的图例进行了分析。对于面板A、C和E，显示了三次测定平均值的标准误差，统计显著性由学生的t吨测试。公式图像,P（P）< 0.05;公式图像公式图像,P（P）< 0.01; NS，统计上不显著。二AcH3 K9/K14，二乙酰化H3 K8/K14；二甲基化H3K9；hCYP7A1，人CYP7A1。
图7。
图7。
SHP招募的HDAC和G9a在改变CYP7A1启动子染色质结构中的功能相互作用。（A） TSA治疗完全逆转了G9a对SHP抑制活性的增强。用200 ng Gal4-TATA-luc、300 ng CMV-β-Gal、100 ng Gal4-HNF-4、50 ng pcDNA3-PGC-1、25 ng pcDNA-SHP和500 ng pCMV-G9a共同转染Cos-1细胞，转染后6 h，用增加量的TSA处理细胞16 h，如图所示。测定细胞提取物中的荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性，并通过除以β-半乳糖苷酶的活性来标准化萤火虫的荧光素酶活性。（B和C）。H3K9的脱乙酰化是G9a介导甲基化的先决条件。用100 nM TSA预处理HepG2细胞，1 h后，用25μM CDCA或载体额外处理细胞7 h。（B）通过实时RT-PCR测定CYP7A1 mRNA水平。（C） 使用二乙酰化H3K9/K14、二甲基化H3K9或G9a抗体或正常血清（NS）收集细胞进行ChIP分析。（D） 带的强度由Image J程序确定，并按照图4C的图例进行分析。对于面板B和D，显示了三次测定平均值的标准误差，并通过学生的t吨测试。公式图像,P（P）< 0.05;公式图像公式图像,P（P）< 0.01; NS，统计上不显著；二AcH3 K9/K14，二乙酰化H3 K8/K14；二甲基化H3K9；hCYP7A1，人CYP7A1。
图8。
图8。
G9a-DN对G9a活性的急性肝脏特异性抑制破坏了胆汁酸稳态，并使喂食胆酸的小鼠的Cyp7a1和Cyp8b1失活。约1×109将活性病毒颗粒（Ad-G9a-DN或Ad-empty）注射到小鼠尾静脉，感染后3天，给小鼠喂食正常或0.5%的含胆酸食物5小时或24小时。收集肝脏、胆囊和小肠进行进一步分析。（A） 每组3只感染Ad-empty或Ad-G9a-DN病毒的小鼠制备肝细胞核提取物，并用SHP抗体（Ab）或对照IgG免疫沉淀。在体外HMT试验中，免疫沉淀用作酶源。GST-H3（1-84）（WT）或GST-H3突变体（H3R9）用作组蛋白底物。HMT反应样品的分析如图2A图例所示。（B） 根据喂食正常或0.5%胆酸补充食物5h或24h的小鼠的胆囊、肝脏和整个小肠中的胆汁酸水平测量总胆汁酸池大小。总胆汁酸池大小按照材料和方法中的描述进行测定。显示了3只小鼠样本平均值的标准误差。公式图像,P（P）< 0.05; NS，统计上不显著。（C和D）小鼠感染了Ad-G9a-DN或Ad-empty病毒，3天后，给小鼠喂食正常或含0.5%胆酸的食物5小时或24小时。作为对照，还对正常未感染的小鼠进行了平行分析。从肝脏中分离出总RNA，并使用Cyp7a1、Cyp8b1和SHP特异性引物集进行实时定量RT-PCR，PCR产物数量除以36B4 PCR产物数量。显示了6只喂食5小时的小鼠和3只喂食24小时的小鼠的样本的平均值标准误差。一名学生分析了Ad空和Ad-G9a-DN感染样本之间的差异t吨测试。公式图像,P（P）< 0.05; NS，统计上不显著。
图9：。
图9：。
在SHP介导的肝胆汁酸代谢中CYP7A1抑制中，协调HDAC、G9a和Swi/Snf-Brm的顺序招募。胆汁酸诱导的SHP可能在CYP7A1启动子处与共激活物HAT竞争，包括p300、CBP和SRC-1，这有助于组蛋白乙酰化的降低，如前所述。SHP分别通过其C和N末端与HDAC和G9a直接相互作用，将这些辅因子招募到启动子中，导致H3K9处的脱乙酰化和随后的二甲基化。H3K9甲基化和去乙酰化为Swi/Snf-Brm复合物的募集创造了一个结合表面，导致ATP依赖性染色质重塑和随后的CYP7A1基因沉默。
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参考文献

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