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.2006;34（22）：e148。
doi:10.1093/nar/gkl967。 Epub 2006年11月16日。

选择性剪接细胞屏的双色荧光报告

詹姆斯·奥伦戈 1, 唐尼·邦德曼, 托马斯·A·库珀
附属公司

选择性剪接细胞屏的双色荧光报告

詹姆斯·奥伦戈等。 核酸研究. 2006.

摘要

选择性剪接是后生动物蛋白质组复杂性的主要来源，其调节形成蛋白质组以响应不断变化的生理需求。我们开发了一种双色剪接报告子，该报告子利用一些荧光蛋白编码区的一个特殊特征来表达来自单个选择性剪接事件的两种不同荧光蛋白。来自单个报告者的不同荧光蛋白的互斥表达为高通量筛选和分析转基因动物混合细胞培养物和组织中的细胞特异性剪接事件提供了一种独特的敏感方法。该报告器适用于大多数选择性剪接模式，可用于量化单个细胞内的选择性剪接，并选择表达特定剪接模式的细胞。对选择性剪接和高通量筛选进行定量单细胞分析的能力将促进理解剪接调控网络和识别逆转致病性剪接缺陷的化合物的进展。

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数字

图1
图1
选择性剪接途径中dsRED和EGFP的双色表达策略。(一)dsRED的三个读取帧显示dsRED ORF（红色）并说明+1读取帧缺少翻译停止密码。穿过整个阅读框的线表示翻译停止密码子，延伸到阅读框底部三分之一的线表示ATG密码子。(B类)表达结构用于确定dsRED的替代ORF是否在哺乳动物细胞中有效表达。FRE5和FRE5Cf的不同之处在于NLS和dsRED编码区域之间插入或删除了2 nt（ClaI填充）。预测的蛋白质显示在基因图的上方。箭头指示转录起始。
图2
图2
利用交替开放阅读框表达来自FRE5和FRE5Cf mRNA的dsRED和EGFP。(一)蛋白质印迹分析显示FRE5（EGFP）和FRE5Cf（dsRED）FLAG标记蛋白的有效表达。FlagNLSGFP是用于阳性对照的带有FLAG标记的GFP版本。(B类)FRE5Cf中dsRED和FRE5中EGFP的核表达。荧光显微镜显示，FLAG–NLS交替dsRED ORF–EGFP融合蛋白在核仁定位增强的细胞核中表达，而FLAG–NSS–dsRED则显示出更为弥散的细胞核分布。EGFP融合蛋白的核苷酸定位在细胞系之间是可变的（数据未显示）。
图3
图3
cTNT的双色选择性剪接报告子。(一)RG6小基因图。28 nt盒外显子的选择性剪接在dsRED和EGFP之间移动阅读框。所示的限制位点是质粒特有的。(B类)RG6瞬时转染到COSM6中，可以单独转染，也可以与Xpress-ETR-3（促进外显子内含）或FLAG–MBNL3（促进外隐子跳跃）联合表达。RT–PCR分析显示MBNL3抑制外显子，ETR-3激活外显子。外显子内含子百分比是通过顶部带的强度除以顶部带和底部带的强度之和×100来计算的。结果来自四个独立的转染。使用抗FLAG抗体的Western blot分析显示FLAG标记的EGFP和dsRED蛋白的表达。RG6PE（正外显子）和RG6ME（负外显子。RG6+MBNL3车道中的附加频带（用星号表示）为FLAG–MBNL3。(C类)RG6报告质粒的荧光显微镜。仅表达RG6的培养物中的细胞含有dsRED和EGFP的核染色，与~1:1外显子内含物一致：在B组中通过RT–PCR检测到跳跃现象。RG6+ETR-3明显显示出向几乎完全表达EGFP转变，RG6+MBNL3显示出向dsRED的强烈转变。EGFP与dsRED荧光的定量如表1所示。
图3
图3
cTNT的双色选择性剪接报告子。(一)RG6小基因图。28 nt盒外显子的选择性剪接在dsRED和EGFP之间移动阅读框。所示的限制位点是质粒特有的。(B类)RG6瞬时转染到COSM6中，可以单独转染，也可以与Xpress-ETR-3（促进外显子内含）或FLAG–MBNL3（促进外隐子跳跃）联合表达。RT-PCR分析显示MBNL3抑制外显子，ETR-3激活外显子。外显子内含子百分比是通过顶部带的强度除以顶部带和底部带的强度之和×100来计算的。结果来自四个独立的转染。使用抗FLAG抗体的Western blot分析显示FLAG标记的EGFP和dsRED蛋白的表达。RG6PE（正外显子）和RG6ME（负外显子。RG6+MBNL3车道中的附加频带（用星号表示）为FLAG–MBNL3。(C类)RG6报告质粒的荧光显微镜。仅表达RG6的培养物中的细胞含有dsRED和EGFP的核染色，与~1:1外显子内含物一致：在B组中通过RT–PCR检测到跳跃现象。RG6+ETR-3明显显示出向几乎完全表达EGFP转变，RG6+MBNL3显示出向dsRED的强烈转变。EGFP与dsRED荧光的定量如表1所示。
图4
图4
通过流式细胞术分析RG6表达细胞。确定同时表达红色和绿色的细胞在RG6单独样本中被选通，因此50%的细胞位于方框A（绿色）中，另50%位于方框B（红色）中。计算与MBNL3或ETR-3共转染的细胞对方框A的支持率。这个百分比代表了表达更多绿色和更少红色的细胞的相对位移，表明剪接调控发生了变化。y轴（PE）是红色荧光的强度，x轴（FITC）是绿色荧光的强度。
图5
图5
RG6双色报告基因在未分化细胞中的表达(一)或差异化(B类和C类)C2C12小鼠骨骼肌培养。在C2C12成肌细胞分化过程中，cTNT替代外显子从外显子跳跃和包含转移到外显子包含（16）。表达RG6小基因的未分化培养物中的绝大多数细胞含有红色和绿色核荧光（图A）。分化培养物包含分化肌管中的细胞核链，这些细胞核链只表达EGFP（外显子内含物）（B和C，实心箭头）。同一培养物中未分化的单核细胞表达核红色和绿色荧光，指示两种剪接模式（面板C，开放箭头）。
图6
图6
RG6双色报告基因在原代骨骼肌培养物中的表达一和B类). 鸡胸肌培养物瞬时转染RG6，然后检测荧光。（A） 分化肌管内发现的核链表达EGFP，但未检测到dsRED，表明预期的外显子内含子剪接模式。（B） EGFP在肌管中的独家表达（实心箭头）以及成纤维细胞中的红色和绿色荧光（开放箭头）。
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