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.2006年11月15日；20(22):3089-103.
doi:10.1101/gad.1463706。 Epub 2006年11月3日。

DNMT1和G9a之间的直接相互作用在复制过程中协调DNA和组蛋白甲基化

Pierre-Olivier Estève公司 1, Hang Gyeong Chin公司, 安德烈亚·斯莫尔伍德, 乔治·费赫里, 奥姆卡拉姆·甘吉塞蒂, 亚当·卡普夫, 迈克尔·F·凯里, 斯里哈尔萨·普拉丹
附属公司

DNMT1和G9a之间的直接相互作用在复制过程中协调DNA和组蛋白甲基化

Pierre-Olivier Estève公司等。 基因开发. .

摘要

染色质甲基化是哺乳动物发育过程中稳定抑制基因表达所必需的。在细胞分裂期间，DNMT1保持新合成子链的DNA甲基化模式，而G9a甲基化H3K9。在这里，DNMT1在体内和体外都能直接结合G9a，并在DNA复制过程中与细胞核共定位。DNMT1和G9a的复合物与二甲基化H3K9（H3K9me2）在复制焦点共定位。类似地，另一个H3K9组蛋白甲基转移酶SUV39H1在细胞分裂前与DNMT1在核仁的异色区共定位。在染色质复制过程中，DNMT1和G9a与载量因子PCNA以三元复合物同时加载到染色质上。DNMT1的小干扰RNA（siRNA）敲除会损害DNA甲基化、G9a负载和染色质和rDNA重复上的H3K9甲基化，从而证实DNMT1是主要负载因子。此外，DNMT1和G9a的复合物导致体外组装染色质底物的DNA和组蛋白甲基化增强。因此，DNMT1和G9a之间的直接合作提供了细胞分裂期间协调DNA和H3K9甲基化的机制。

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数字

图1。
图1。
DNMT1和G9a之间的相互作用。(A类)DNMT1和G9a在用GFP-G9a和6xHis-DNMT1构建体转染的COS-7细胞的细胞提取物中的免疫共沉淀。用于免疫沉淀的抗体在顶部和分子量标记左边用所示抗体检测每个印迹。(B类)人HCT116细胞内源性DNMT1和G9a的免疫共沉淀。显示了输入的核提取物和使用的免疫沉淀抗体。显示用于Western blot的抗体在下面每个面板。(C类)DNMT1和G9a络合物的色谱分离。凝胶过滤标准蛋白的洗脱曲线（千道尔顿）显示在顶部用于检测不同组分中酶的抗体显示在底部所有三个印迹均针对相同的洗脱组分。(D类)人Jurkat细胞内源性DNMT1和G9a的免疫共沉淀。用于免疫沉淀的输入（DNMT1为8%，G9a为50%）和抗体显示在顶部.显示用于Western blot的抗体在下面每个面板。图中显示了未绑定（U）和绑定（B）G9a和DNMT1。通常，1μg抗体用于IP。注意，所有G9a均由抗G9a免疫沉淀，因为未结合部分不含任何可检测到的G9a。(E类)使用G9a片段的GST融合对G9a上的DNMT1结合区域进行定位。显示了G9a的各种域在上面面板以及GST融合结构的示意图。来自GST下拉实验的Ponceau染色转移蛋白以及使用抗DNMT1的Western blot显示。融合蛋白的位置用星号标记。融合蛋白中的氨基酸显示在括号中顶部污渍。(F类)使用DNMT1的不同区域以及氨基酸编号绘制GST融合构建的示意图。GST下拉实验中的Ponceau染色转移蛋白以及其与抗G9a的Western blot。
图2。
图2。
G9a和DNMT1在复制病灶的染色，以及BrdU和H3K9me2用DNMT1或G9a定位。融合蛋白显示在顶部以及所示的BrdU或H3K9me2的免疫细胞化学检测。面板已指定A–H。在左边-的手角B–H，融合蛋白和用于免疫细胞化学的抗体具有相同性。（Nu）经hoechst染色的细胞核；（BrdU）溴脱氧尿苷；（H3K9me2）二甲基化组蛋白H3 Lys 9。使用的DNMT1和G9a融合结构要么与DsRed（DsRed-DNMT1）或GFP（GFP-DNMT1）融合。使用包含GFP或DsRed伴侣以及括号中所示G9a或DNMT1部分的融合蛋白。(A类)G9a和DNMT1在细胞周期中的共定位。上左边在面板的侧面，以小时为单位的同步化后细胞化学观察以及DNMT1和G9a融合处的细胞百分比。对于每个阶段（在0时间[面板我]，2至4小时[面板二]，8至12小时[面板三]，15小时后[面板四、]蚜虫灵处理后），计数20～50个细胞。(B类)DNMT1（1–446）和G9a。(C类)DNMT1（1-502）和G9a（1-598）。(D类)DNMT1（1-502）和G9a（1-464）。(E类)G9a和BrdU。(F类)DNMT1和BrdU。(G公司)H3K9me2和G9a。(H（H）)DNMT1和H3K9me2。氨基酸数字在括号内。
图3。
图3。
DNMT1和SUV39H1之间的颜色化和相互作用。(A类)异染色质中SUV39H1和H3K9me3的细胞化学定位。(B类)异染色质中DNMT1和H3K9me3的细胞化学定位。(C类)使用DNMT1的重叠GST融合片段对DNMT1上的SUV39H1-结合区域进行定位。显示DNMT1的各种GST融合在上面括号中有氨基酸，使用的抗体如所示正确的. (D类)DNMT1及其SUV39H1-绑定区域示意图在下面. (E类)SUV39H1和DNMT1在DNA复制过程中不共定位，但在异染色质中相关。上左边给出了同步化后的细胞化学观察结果，以及DNMT1和SUV39H1融合的细胞百分比。对于每个阶段（在0时间[面板我]，2至4小时[面板二]，8至12小时[面板三]，15小时后[面板四、]蚜虫灵处理后），计数20～50个细胞。
图4。
图4。
DNMT1促进G9a介导的染色质甲基化。(A类)在S期，DNMT1和G9a同时加载到染色质上。用胸腺嘧啶核苷和蚜虫灵使HeLa细胞同步化并释放到常规培养基中。发布后的时间点（以小时为单位）显示在顶部用于西方分析的抗体在底部染色质组分用于印迹，如图所示。(B类)S期早期PCNA上DNMT1和G9a招募分析。发布后的时间点（以小时为单位）显示在顶部抗体用于西方分析底部。对PCNA进行标准化西方分析加载，以确定DNMT1和G9a招募。(C类)DNMT1敲除损害G9a负载和H3K9甲基化。总细胞提取物的蛋白质印迹分析(左边)和染色质(正确的)如图所示。使用的抗体在底部以及DNMT1（DNMT1 KD）和G9a（G9a KD）的siRNA介导的敲除在顶部用siLitmus进行对照击倒（对照KD）。(D类)G9a和BrdU在DNMT1击倒COS-7细胞中的定位。BrdU被染成红色，GFP-G9a被视为绿色。部分敲除细胞用于Western blot分析，以确定DNMT1的敲除程度，如正确的面板。组蛋白H3用作对照。(E类)与中的相同D、，但这些细胞在HCT116背景中被DNMT1基因敲除。
图5。
图5。
IGS-rDNA的甲基化特异性PCR分析。(A类)在DNMT1敲除基因组中，DNMT1的siRNA(顶部)或G9a(底部)用斑马素耗尽内源性DNMT1(正确的). 预期的基因特异性带为～110 bp。显示了非甲基化（U）和甲基化（M）基因特异性产品。(B类)IGS-rDNA基因座的ChIP分析。在左上角面板中，带有CpG残基的110-bp基因座的折线图显示为垂直填充框。这个正确的面板显示了敲低输入DNA的线性PCR扩增。这个底部面板显示了ChIP分析的PCR产物。用于IP的抗体显示在顶部并且击倒条件显示在底部. (C类)IGS-rDNA基因座中各种组蛋白H3修饰的Q-PCR分析。淘汰状态显示在底部.
图6。
图6。
体外通过DNMT1和G9a的相互作用进行甲基化活化。(A类)DNMT1和G9a存在时DNA甲基化激活。以不含DNMT1结合区的缺失突变体G9a（delG9a）作为对照。体外反应中的成分显示在底部显示了未甲基化和半甲基化的DNA底物。甲基并入如图所示左边每个反应重复两次。(B类)DNMT1在HCT116核小体底物上刺激组蛋白甲基化。反应组分显示在底部图形的。G9a和delG9a用于甲基化反应。氚甲基掺入量以每分钟计数为单位左边反应重复两次。(C、 顶部)G9a将DNMT1加入核糖体阵列。核糖体阵列上的预结合G9a如顶部以及辅因子AdoMet。DNMT1浓度增加，如顶部以及用于DNMT1负载检测的抗体，如正确的. (底部)delG9a的一个类似实验取消了DNMT1招募。(D类)G9a以非复制方式刺激DNMT1催化。使用的预绑定组件在顶部.随后用DNMT1和三H-AdoMet，如图所示。甲基化DNA的荧光显示在顶部G9a加载到染色质上的Western blot显示在底部带有车道号。
图7。
图7。
DNMT1/G9a复合物染色质甲基化模型。(A类)在DNA复制过程中，PCNA–DNMT1复合体招募G9a。随着复制叉的移动，与G9a-介导的H3K9二甲基化同时发生维持DNA半甲基化的事件。未甲基化和甲基化CpG显示为开放式和封闭式棒棒糖。辅因子AdoMet用作甲基供体。(B类)复制后染色质甲基化涉及DNMT1-G9a和DNMT1-SUV39H1复合物。SUV39H1可以利用其色域与H3K9me2（蓝填充星）结合并催化H3K9三甲基化。DNMT1可以甲基化未甲基化的CpG位点。G9a–DNMT1配合物可以与H3K9me2（中间产物）结合，对H3K9三甲基化反应（H3K9-me3，填充星）的亲和力较低。G9a在DNMT1复合物中的存在将激活DNMT1催化，以实现额外的从头甲基化（甲基化扩散），如癌细胞中沉默基因所示。(C类)SUV39H1和DNMT1的甲基化依赖性基因抑制和异色定位。复制后染色质甲基化后，细胞核的异染色质成分富含H3K9me3，这是HP1结合的平台。HP1招募SUV39H1和DNMT1用于阻遏物复合物的形成。DNMT1可以招募其他阻遏物成分，如HDAC1。然而，甲基化的染色质可能会去甲基化，进入甲基化循环。
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