Pharmacologic manipulation of sphingosine kinase in retinal endothelial cells: implications for angiogenic ocular diseases

doi:10.1167/iovs.05-1236

.2006年11月；47(11):5022-31.

doi:10.1167/iovs.05-1236。

鞘氨醇激酶在视网膜内皮细胞中的药理学操作：对血管生成性眼病的意义

Lynn W Maines公司¹, Kevin J法语, 艾伦·B·沃尔珀特, 大卫·A·安东尼蒂, 查尔斯·德·史密斯

附属公司

PMID： 17065523
预防性维修识别码： PMC2660407型
内政部： 10.1167/iovs.05-1236

视网膜内皮细胞鞘氨醇激酶的药理操作：对血管性眼病的影响

Lynn W Maines公司等。投资眼科视觉科学. 2006年11月.

.2006年11月；47(11):5022-31.

doi:10.1167/iovs.05-1236。

作者

Lynn W Maines公司¹, Kevin J法语, 艾伦·B·沃尔珀特, 大卫·A·安东内蒂, 查尔斯·德·史密斯

附属

¹远地点生物技术公司，美国宾夕法尼亚州好时。

PMID： 17065523
预防性维修识别码： PMC2660407型
内政部： 10.1167/iovs.05-1236

摘要

目的：糖尿病视网膜病变中观察到的血管通透性增加和致病性血管生成至少部分是由局部炎症和血管内皮生长因子（VEGF）诱导的。因此，抑制VEGF和肿瘤坏死因子α（TNFalpha）的信号传导是治疗该疾病以及具有类似病因的眼部疾病（包括年龄相关性黄斑变性）的一种有希望的方法。越来越多的证据表明，鞘氨醇激酶（SK）在细胞增殖和血管生成中发挥着重要作用。本研究旨在研究SK抑制剂对视网膜内皮细胞（RECs）对VEGF和TNFalpha的反应的影响及其在糖尿病视网膜病变模型中的治疗效果。

方法：通过免疫印迹分析检测SK在牛和人REC中的表达和功能。通过在细胞和体内试验中使用SK的药物抑制剂，包括在大鼠体内建立3个月链脲佐菌素诱导的糖尿病视网膜病变模型，检测SK在介导VEGF和TNFalpha反应中的作用。

结果：SK存在于人和牛REC中并具有活性，这些细胞中的SK活性受到VEGF的刺激。SK抑制剂阻断VEGF诱导的1-磷酸鞘氨醇的生成，并显著减弱VEGF诱发的REC增殖和迁移。此外，SK抑制剂被证明可以阻止TNF诱导的粘附蛋白表达，在体内小鼠模型中抑制VEGF诱导的血管渗漏，并在大鼠糖尿病视网膜病变模型中减少视网膜血管渗漏。

结论：总的来说，这些研究表明，SK抑制剂可在体内外减弱增殖和炎症刺激对REC的影响，因此可能是治疗糖尿病视网膜病变的重要疗法。

PubMed免责声明

数字

**图1。SK在RECs中的表达**
**面板A。**从JC小鼠乳腺癌细胞（Lane 1）、牛RECs（Lane 2）或大鼠大脑皮层内皮细胞（Lane3）中制备细胞裂解物，并使用SK抗体进行免疫印迹分析，如材料和方法部分所述。显示了代表SK的免疫反应带。**面板B。**从四种独立的人类REC制剂（1-4通道）制备细胞裂解物，并如上所示评估SK的表达。在每种情况下，用抗肌动蛋白抗体复制后，装载等量的蛋白质。

**图2。REC中细胞SK活性的抑制**
牛REC与20μM DMS或25μg/mL SKI-I、SKI-II或SKI-V（每个化合物约80μM）孵育4小时，然后添加0.4μCi[^三H] 鞘氨醇。15分钟后，用氯仿：甲醇溶解细胞并提取。总金额[^三H] 有机相中的鞘氨醇和[^三H] 然后按照材料和方法一节中的描述测定水相中的S1P。数值代表典型实验中重复样品的平均值±SD。

**图3。SKI-II对HREC的毒性**
将人REC缺血清24小时，然后不处理12小时（■），或在SKI-II指示浓度下与50 ng/mL VEGF（▲）孵育14小时。选择这些方案以精确匹配下述SK活性和增殖实验中的条件。孵育后，按照材料和方法一节中的描述，测定处理后存活的细胞百分比。数值表示典型实验中三份样品的平均±SD细胞存活率。

**图4。SKI-II对REC中VEGF刺激SK活性的影响**
将牛REC缺血清24小时，然后在DMS（D）或SKI-II指示浓度（μM）存在下，不处理或与VEGF（50 ng/mL）孵育12小时[^三H] 然后将鞘氨醇添加到细胞中，并将其转化为[^三H] S1P的测定如材料和方法一节所述。数值代表典型实验中重复样品的平均值±SD。

**图5。SKI-II对VEGF刺激RECs增殖的影响**
**面板A。**将人REC缺血清24小时，然后在SKI-II指示浓度（μM）存在的情况下不处理或与VEGF（50 ng/mL）孵育12小时[^三H] 然后加入胸苷并将培养物再孵育2小时。**面板B。**人类REC缺乏血清，并与上述指示浓度的SKI-II孵育。然后用VEGF（实心条）或VEGF加100 nM S1P（交叉阴影条）处理细胞12小时，然后用[^三H] 胸腺嘧啶持续2小时[^三H] 按照材料和方法一节中的描述，测定DNA中的胸苷。数值代表典型实验中重复样品的平均值±SD。

**图6。SKI-II对VEGF诱导RECs Erk磷酸化的影响**
将人REC无血清培养24小时，然后不进行处理（通道1和3）或用10μM SKI-II（通道2和4）培养12小时。VEGF（50 ng/mL）然后将其添加到Lanes 3和Lanes 4中所示的样品中15分钟，然后制备细胞裂解物，并按照材料和方法部分所述评估磷酸化Erk1/2和总Erk1/2蛋白的表达。

**图7。SKI-II对TNFα诱导的RECs Cox-2和粘附分子表达的影响**
**面板A。**将人REC无血清培养24小时，然后不进行处理（通道1和通道2）或与20μM SKI-II（通道3）孵育12小时。然后将TNFα（100 ng/mL）添加到通道2和通道3中显示的样品中6小时，然后制备细胞裂解物。**面板B。**将人REC缺血清24小时，然后不进行处理（通道1和通道2）或与20μM SKI-II（通道3和通道4）孵育12小时。然后将TNFα（100 ng/mL）添加到通道2和通道3所示的样品中，而在制备细胞裂解物之前，将TNF甲加100 nM S1P添加到通道4所示的样本中6小时。如材料和方法部分所述，对样本进行E-selectin、VCAM-1、Cox-2、磷酸化-NFκB或肌动蛋白表达评估。

**图8。VEGF和SKI-II对RECs形成血管样管的影响**
人REC被镀入Matrigel-coated微孔中，并用DMSO（作为溶剂对照）、VEGF（50 ng/mL）或VEGF加20μM SKI-II处理。在37°C下18小时后，按照材料和方法一节中的描述对细胞进行数字成像。显示了具有代表性的字段。

**图9。SK抑制剂对VEGF诱导血管渗漏的影响**
用DMSO（作为溶剂对照）或SK抑制剂治疗裸鼠。30分钟后，静脉注射Evan’s Blue染料，然后按照材料和方法一节中的描述，给动物皮下注射PBS或400 ng VEGF。**面板A。**显示了一只用100 mg/kg SKI-II治疗的代表性小鼠，其左后侧翼显示出VEGF的皮下注射部位。右侧注射PBS作为对照。**面板B。**一只代表性对照动物的左后侧翼出现了典型的、明显的VEGF诱导的渗漏，右侧出现了PBS对照注射侧的注射部位标记。**面板C。**量化A部分和B部分动物的血管渗漏面积（对照组和SKI-II治疗组分别为3和5）。**面板D。**裸鼠经腹腔注射载体（对照组，开条）或75 mg/kg ABC294640（孵化条）或100 mg/kg ABC2 94640经口灌胃（实心条），然后按上述方式给药Evan’s Blue染料和VEGF。数值代表血管渗漏的平均±SD面积*p<0.01。

**图10。糖尿病大鼠视网膜血管通透性增加**
Sprague-Dawley大鼠被注射缓冲液（对照组）或链脲佐菌素（糖尿病组），并未经治疗45天。此时，将动物静脉注射FITC-BSA，30分钟后处死动物。按照材料和方法一节中的描述，通过荧光显微镜对每个视网膜进行采集、切片和成像。**面板A**表示对照鼠的代表性部分，而**面板B**是一只典型的糖尿病鼠的图像。标记内丛状（IP）、外核和自荧光光感受器（PE）层。在对照组大鼠的视网膜切片中，荧光仅限于血管腔，而糖尿病大鼠的切片显示出更均匀的分布在整个视网膜，表明存在血管渗漏。**面板C。**对来自对照组（开栅）和糖尿病组（阴影栅）大鼠的内丛状和外核层中FITC-BSA的相对光强进行了量化。数值代表4只大鼠的平均值±sd。

**图11。ABC 294640对糖尿病大鼠视网膜血管通透性的影响**
从第45天到第87天，用25 mg/kg（水平影线条）或75 mg/kg（交叉影线条）的溶剂（阴影条）或ABC294640处理对照（开放条）和糖尿病大鼠。在第87天，按照材料和方法部分的说明测量每只动物的视网膜渗漏。值代表每组3-5只大鼠的平均±sd。

**图12。对照组和糖尿病大鼠视网膜鞘氨醇激酶的表达**
在第87天从对照组（A组）或糖尿病大鼠（B组）或ABC294640溶剂组（C组）或75 mg/kg（D组）制备视网膜切片。用兔多克隆抗体和次级Cy5连接的抗兔抗体（红色）对切片进行SK染色，用Hoescht（蓝色）对细胞核进行染色。图像代表每组3-5只大鼠。

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