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。2006年11月1日；177(9):6172-81.
doi:10.4049/jimmunol.177.9.6172。

Bap31增强人Ⅰ类MHC分子的内质网输出和质量控制

约翰·拉达斯基 1, 莎拉·博伊尔, 马利尼·塞思, 李和旺, 茨维特琳娜·彭切娃, 安倍富美, 史蒂文·J·斯坦伯格, 迈克尔·爱迪丁
附属公司

Bap31增强人Ⅰ类MHC分子的内质网输出和质量控制

约翰·拉达斯基等。 免疫学杂志。 。

摘要

I类MHC分子的组装及其从内质网（ER）的输出受伴侣蛋白和辅助蛋白的调控。我们提供的证据表明，假定的货物受体蛋白Bap31参与人类I类分子的运输和质量控制。用黄色荧光蛋白-Bap31嵌合物转染人类腺癌细胞系HeLa后，I类表面水平以剂量依赖性的方式增加了3.7倍。表面类别I的增加是由于新合成的类别I分子向细胞表面的输出速率增加，以及输出分子的稳定性增加。我们提出Bap31在两个不同的阶段对I类分子进行质量控制：第一，通过将肽负载的I类分子输出到ER/Golgi中间室，第二，通过回收在酸性ER后环境中丢失肽的I类化合物。Bap31的这种功能是有条件的或多余的，因为我们发现Bap31缺乏并不会降低表面I类水平。Bap31同源物Bap29的过度表达降低了HeLa中的表面类水平，表明它不能替代Bap31。

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图1
图1
Bap31与I类MHC分子的共免疫沉淀。A）Bap31与单克隆抗体CC-1的Western blotting。用单克隆抗体KE2（顶行）连续免疫沉淀HeLa细胞完整组装的I类MHC。清除的上清液（右车道顶行）含有额外的Bap31。游离的I类重链用mAb HC10连续免疫沉淀（中间行）；相关的Bap31被鉴定为KE2。Bap31还与Daudi细胞中的自由重链相关（最下面一行）。B）HeLa细胞转染表达HLA-A2跨膜和细胞质结构域融合到YFP（左）的构建物，或表达全长HLA-A2融合到YFP（右）的pA2-YFP-N3的构建物。用抗GFP抗体免疫沉淀YFP标记的分子。用抗GFP（顶行、中行）或CC-1（底行）检测斑点。C）用表达YFP-Bap31（顶行）或Bap31-YFP（底行）的构建物转染HeLa细胞。I类用KE2连续免疫沉淀，并用抗GFP探针检测印迹。嵌合蛋白与可能为IgH的非特异性带（*）接近；全细胞裂解液（未显示）和清除的上清液（右栏）中没有该条带。
图2
图2
共聚焦荧光显微镜下Bap31的亚细胞定位。在HeLa细胞中A）抗calnexin抗体染色和B）YFP-Bap31荧光显示内质网的网状染色模式特征。C）面板A和面板B的重叠显示，calnexin和Bap31的共同定位广泛但不完整，Bap31富集在calnexin-oor核周区域。在赫拉，D）抗ERGIC-53染色和E）YFP-Bap31荧光为F）视觉上相关性不强，但在二维荧光相关直方图上相关性明显（插图）(33). 在这个直方图中，红色和绿色像素强度分别绘制在水平轴和垂直轴上；最小二乘-fit（对角线黄线）用于搜索一对阈值（黄色水平线和垂直线），它们在对角线处相交，正好位于相关系数为零的数据子集的上方。G、 H、I）分别与D、E、F相同，但与X-ALD成纤维细胞相同。表I中给出了相关系数和共定域百分比，以及阴性和阳性对照的值。
图3
图3
Bap31和tapasin过度表达对HeLa细胞表面跨膜蛋白稳态水平的影响。用游离YFP、Bap31-YFP（克隆1D5）、YFP-Bap31（克隆B8、C1和E2）或YFP-tapasin转染细胞。A）黄色荧光水平，提供转染蛋白表达水平的估计。B）KE2-Cy5标记的表面I类MHC水平随着YFP-Bap31表达的增加而增加。YFP-Bap31的表达不会影响其他七种蛋白质的表面水平：C）CD9，一种III型蛋白质D）CD55和E）CD59，gpi-连接蛋白F）CD71，一种II型蛋白质G）CD95和H）CD147，I型跨膜蛋白。在B-H中，表达水平归一化为未转染HeLa细胞的表达水平。
图4
图4
Bap31过度表达加速了I类MHC的成熟。HeLa细胞和YFP-Bap31转染体经脉冲处理[35S] Cys+Met，用未标记氨基酸追踪0–120分钟，裂解，并用抗MHC抗体KE2免疫沉淀。每个样本的一半用内切糖苷酶H处理，这样还没有达到中高尔基体的新生内切H敏感型I类就可以与成熟内切H抗性型I类区分开来。A）典型的放射自显影。显示了未转染的HeLa细胞和YFP-Bap31克隆E2。在经过内切H处理的车道上观察到四条谱带。下两条谱带代表内切H敏感（endoS）I类；上部两个波段，内抗H（内抗R）。B）根据A组放射自显影定量密度测定计算的成熟率。一级指数曲线与数据相吻合。未转染HeLa（方形，细线）中EndoS-I类药物的半衰期为20.1分钟；克隆E2（圆圈，粗线），13.4分钟。C）所有脉冲期实验中测量的成熟率总结，归一化为未转染HeLa细胞的成熟率。圆圈和正方形表示根据两天的实验计算出的速率。实心棒的高度表示平均相对成熟率。D）Bap31过度表达对用木瓜蛋白酶剥离I类表面后I类分子再现的影响。数据拟合出一阶指数曲线。图中显示了一组来自未转染HeLa（正方形，细线）和一组来自克隆E2（圆形，粗线）的测量值。E）木瓜蛋白酶治疗后测量的I类恢复率总结，归一化为未转染HeLa细胞的恢复率。圆形、正方形和实心条形图如C）所述。YFP-Bap31和YFP-tapasin转染剂都比未转染的HeLa更快地将I类分子输出到细胞表面。
图5
图5
Bap31过度表达增加了表面I类MHC分子的稳定性。通过在含有brefeldin A的培养基中培养细胞，阻止新生的I类细胞向细胞表面的输出。通过使用KE2-Cy5的流式细胞术，在36小时内监测I类表面的损失。A）对照未转染HeLa细胞中I类表面的损失随时间的变化。所示曲线是最佳的一阶指数衰减拟合（细线）和最佳的二阶拟合（粗线）。将I类MHC（y）的表面浓度描述为时间（t）的函数的二阶曲线拟合方程为y=x1−吨/吨+2个−t/t2。B）不稳定I类人群的半衰期（平均值±SEM）（t1），C）稳定类I的半衰期（t2），以及D）稳定与不稳定I类的比率（r=x1/x2）。
图6
图6
Bap31耗尽对表面I类MHC分子的稳态水平和稳定性的影响。A）用siRNA处理YFP-Bap31克隆B8BAP31号机组（黑线）或无意义siRNA（灰色填充）。失去黄色荧光表明BAP31号机组小干扰RNA。B）siRNA缺失BAP31号机组约为稳态水平的1/3并没有降低表面I级水平（黑线）。针对企业对企业是I类耗竭的阳性对照，约70%的HeLa细胞表面I类水平（灰色填充）降低了五倍。未经处理的HeLa细胞和用无义siRNA对照（未显示）处理的HeLa细胞的表面I类水平与用BAP31号机组小干扰RNA。C）野生型人类成纤维细胞0498B和5659C、X-ALD成纤维细胞110362和303617以及CADDS成纤维细胞CADDS4和CADDS5的正常稳态表面I类水平。
图7
图7
Bap29-YFP表达降低表面I类水平。A）用Bap29-YFP瞬时转染HeLa细胞，并用双色流式细胞术进行分析。通过高水平的黄色荧光（矩形，右上角）鉴定转染细胞。B）从面板A扩展所选区域；最小二乘线性回归拟合显示表面I类水平和Bap29-YFP表达之间呈负相关。C）Bap31-YFP的瞬时转染。D）等量转染BAP29-YFP公司和BAP31-YFP公司质粒。
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