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.2006年10月；131(4):1208-17.
doi:10.1053/j.gastro.2006.07.012。

Raf激酶抑制剂蛋白的缺失促进人肝癌细胞的增殖和迁移

韩楚利（Han Chu Lee） 1, 博天, 约翰·塞迪维, 杰克R魔杖, 金美兰
附属公司

Raf激酶抑制剂蛋白的缺失促进人肝癌细胞的增殖和迁移

韩楚利（Han Chu Lee）等。 胃肠病学. 2006年10月.

摘要

背景和目标：Raf激酶抑制剂蛋白（RKIP）被确定为丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径的抑制剂。RKIP功能的丧失促进前列腺癌和黑色素瘤的肿瘤转移。胰岛素样生长因子I（IGF-I）介导的MAPK级联反应在肝细胞癌（HCC）中经常被激活，但RKIP在这些肿瘤的分子发病机制中的作用尚不清楚。本研究旨在评估RKIP在肝癌发生发展中的作用。

方法：采用免疫组织化学和Western blot分析方法检测肝癌及癌旁组织中RKIP的表达水平。通过免疫印迹分析、Raf激酶活性测定、细胞增殖以及肝癌细胞株中RKIP过度表达或下调后的迁移测定来评估RKIP的潜在机制。

结果：与癌旁组织相比，人肝癌中RKIP表达下调。低RKIP水平与细胞外信号调节激酶（ERK）/MAPK通路激活增强相关。重组实验拮抗IGF-I介导的MAPK通路激活，导致磷酸化ERK的核积累减少。相反，使用小干扰RNA敲低RKIP表达可诱导ERK/MAPK通路激活。RKIP的异位表达改变了肝癌细胞的增殖和迁移。

结论：我们的研究结果表明，RKIP表达下调是人类肝癌发生过程中IGF-I/ERK/MAPK通路激活的主要因素。

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数字

图1
图1
人肝癌组织样本中RKIP蛋白的表达。用抗RKIP抗体（棕色）对肝癌和瘤周区域的代表性病例进行免疫染色，并用苏木精（蓝色）进行复染。放大倍数为200倍(A类)遗漏一级抗体作为阴性对照。(B类)肿瘤周围组织中的低（+）染色。不到50%的肝细胞表现出免疫反应。(C类)瘤周组织中度（++）染色。几乎所有的肝细胞都显示出均匀的中度免疫反应。(天)肿瘤周围组织的强（+++）染色。(E类)HCC肿瘤的阴性（−）染色。
图2
图2
肝癌组织中RKIP蛋白、mRNA和磷酸化ERK的表达。(A类)RKIP和磷酸化-ERK表达水平的Western blot分析。用抗RKIP或抗磷酸化-ER抗体对来自8对HCC肿瘤（T）和瘤周（pT）组织的细胞裂解物进行免疫印迹。Actin充当加载控件。注意，RKIP表达降低的HCC组织中磷酸化-ERK表达增加。(B类)条形图表示通过密度扫描获得的RKIP蛋白水平（T/pT）的比率。8例HCC肿瘤中有7例RKIP表达降低（肿瘤与瘤周组织相比：P（P）< 0.0001). (C类)定量实时RT-PCR测定人肝癌组织中RKIP mRNA的表达水平。RKIP mRNA水平归一化为18S rRNA。条形图显示RKIP的mRNA水平比率（T/pT）。肝癌组织和瘤周组织中RKIP mRNA表达水平无差异（P>0.5）。
图3
图3
RKIP在IGF-I诱导的肝癌ERK/MAPK通路激活中的作用。(A类)肝癌细胞株中RKIP蛋白和ERK/MAPK通路下游成分的表达水平。对含有100µg总蛋白的FOCUS、Huh7、Hep3B和HepG2细胞的细胞裂解液进行RKIP、MEK1、ERK及其磷酸化形式的免疫印迹；肌动蛋白起到了负荷控制的作用。(B类)条形图表示密度分析的结果，并揭示了RKIP和肌动蛋白、磷酸-MEK1和总MEK1以及磷酸-ERK和总ERK的比率(C类)RKIP异位表达阻断了IGF-I诱导的FOCUS细胞ERK/MAPK信号通路。用RKIP或载体质粒瞬时转染细胞。在24小时血清饥饿后，用100 nM IGF-I（+）处理细胞15分钟或不处理细胞（-）。制备细胞裂解物，并对RKIP和通路下游信号成分（c-Raf、MEK1、ERK和磷酸化形式）进行免疫印迹；肌动蛋白起到了负荷控制的作用。(天)条形图描述了密度分析的结果(C类)，表示为RKIP与肌动蛋白、磷酸化c-Raf与总c-Raf、磷酸化-MEK1与总MEK1、磷酸化-ERK与总ERK的比值。结果显示为三次实验的平均值±SE。（E） 用siRNA敲低RKIP表达可激活IGF-I诱导的HepG2细胞ERK/MAPK信号。使用DharmaFECT 4转染试剂用对照si-RNA（C-siRNA）或RKIP-siRNA转染细胞。在血清饥饿后用100 nM IGF-I（+）处理细胞15分钟或未经处理（−）24小时，然后用免疫印迹法检测RKIP和通路下游信号成分（c-Raf、MEK1、ERK和磷酸化形式）；肌动蛋白起到了负荷控制的作用。(F类)条形图描述了密度分析的结果(E类)、和表示为RKIP和肌动蛋白、磷酸化-c-Raf和总c-Raf、磷酸化-MEK1和总MEK1、磷酸化-ERK和总ERK的比率。
图4
图4
RKIP表达水平影响Raf激酶活性。(A类)肝癌细胞系中RKIP蛋白的表达。在FOCUS细胞中，转染空载体（C）或RKIP表达质粒。对照siRNA（C-siRNA）或RKIP-siRNA转染HepG2细胞。在血清饥饿24小时后，用（+）或不使用（−）IGF-I处理细胞10分钟。肌动蛋白的Western blot作为对照，以使蛋白质浓度正常化。(B类)Raf激酶活性测定。用小鼠单克隆抗Raf抗体免疫沉淀每个样品的500微克蛋白质，然后进行材料和方法中所述的Raf激酶活性测定。对MEK的印迹进行剥离和重复，证明添加了等量的重组MEK-1底物。“w/o裂解物”通道表示不添加细胞裂解物的分析，并用作阴性对照。“活性Raf”通道表示使用从0.1µg活性Raf蛋白中获得的免疫沉淀物作为阳性对照进行分析。免疫沉淀Raf蛋白显示磷酸化MEK（pMEK）。条形图表示通过密度扫描获得的pMEK水平（pMEK与MEK）。请注意，RKIP的过度表达降低了FOCUS细胞中的Raf激酶活性，而RKIP被敲除则诱导了HepG2细胞中的活性。
图5
图5
RKIP水平的恢复抑制了FOCUS细胞中磷酸化ERK核的积聚。(A类)用（+）或（-）100 nM IGF-I刺激RKIP或转染载体的FOCUS细胞15分钟。免疫印迹法检测细胞液和核组分的RKIP、磷酸化ERK（pERK）和总ERK表达；肌动蛋白和组蛋白-H1分别起到细胞溶质和核负荷控制的作用。(B类)用RKIP（红色）和磷酸化-ERK（绿色）对对照组和RKIP转染的FOCUS细胞（生长在培养箱载玻片上）进行免疫染色，用DAPI（蓝色）对细胞核进行复染。底部面板显示了磷酸化ERK和DAPI染色的合并图像，表明核共定位。箭头表示核pERK。
图6
图6
RKIP的恢复降低了FOCUS细胞的增殖和迁移。用空载体（对照）或RKIP表达质粒稳定转染FOCUS细胞。(A类)通过蛋白质印迹分析证明RKIP蛋白表达。(B类)RKIP表达抑制FOCUS细胞增殖。细胞在含有或不含100 nM IGF-I的无血清MEM中生长。使用CellTiter 96水性非放射性细胞增殖试验测定细胞增殖。结果表示为三次分析的平均值±SE。IGF-I刺激增加了对照细胞的细胞增殖[C-IGF-I（+）vs.C-IGF-I（−）]，但RKIP转染的FOCUS细胞中的细胞增殖率没有变化[RKIP-IGF-I。P（P）<0.05（第2天和第3天）(C类)RKIP表达抑制FOCUS细胞迁移。为了评估细胞穿过聚碳酸酯膜（孔径为8-µm）的能力4将含有1%BSA的0.5 mL无血清MEM中的细胞置于上部培养箱中，并将含有1%BS A和100 nM IGF-I的0.75 mL无血清ME充满下部培养箱。在37°C下培养3小时后，分别采集上腔细胞和附着在膜上或迁移到下腔的细胞，并将其置于裂解缓冲液中。将ATPLite基板添加到每个组分中，并在TopCount微孔板阅读器中测量每秒的发光计数。结果以迁移细胞占总细胞的百分比表示，实验重复三次。P（P）<0.001（对照组与RKIP）
图7
图7
RKIP抑制FOCUS细胞增殖和运动。将对照FOCUS细胞和稳定的RKIP转染体置于六孔板中。用无菌塑料微量移液管尖端在融合的单层中形成伤口，并通过每次保持开放的伤口区域显示伤口闭合的百分比，如下图所示。注意，FOCUS细胞中异位RKIP表达显著减少了细胞迁移。
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