An interaction between U2AF 65 and CF I(m) links the splicing and 3' end processing machineries

doi:10.1038/sj.emboj.7601331

.2006年10月18日；25(20):4854-64.

doi:10.1038/sj.emboj.7601331。 Epub 2006年10月5日。

U2AF 65和CF I（m）之间的相互作用连接了拼接和3'端加工机械

斯蒂芬妮娅·米列沃¹, 克拉丽斯·卢勒格, 萨宾·德特威勒, 萨拉·泽内布·卡拉, 沃尔特·凯勒, 迈克尔·安东尼乌, 斯特凡·瓦格纳

附属公司

PMID： 17024186
PMCID公司： PMC1618107项目
内政部： 10.1038/sj.emboj.7601331

U2AF 65和CF I（m）之间的交互将拼接和3’端加工机械连接起来

斯蒂芬妮娅·米列沃等。浮雕J. 2006.

.2006年10月18日；25(20):4854-64.

doi:10.1038/sj.emboj.7601331。 Epub 2006年10月5日。

作者

斯蒂芬妮娅·米列沃¹, 克拉丽斯·卢勒格, 萨宾·德特威勒, 萨拉·泽内布·卡拉, 沃尔特·凯勒, 迈克尔·安东尼奥, 斯特凡·瓦格纳

附属

¹法国图卢兹INSERM U563。

PMID： 17024186
PMCID公司： PMC1618107项目
内政部： 10.1038/sj.emboj.7601331

摘要

蛋白因子U2 snRNP辅助因子（U2AF）65是剪接所需的基本成分，参与脊椎动物前mRNA剪接和3'末端加工的耦合。在这里，我们讨论了U2AF 65刺激前mRNA 3'末端处理的机制。我们确定了U2AF 65的精氨酸/丝氨酸丰富区域，该区域介导与人类卵裂因子I（CF I（m））的59kDa亚基的RS-样交替电荷域的相互作用，这是一种在识别3'末端处理信号的早期阶段起作用的重要3'处理因子。系带功能分析表明，U2AF 65/CF I（m）59相互作用刺激体外3’末端裂解和聚腺苷酸化。因此，这些结果揭示了U2AF 65/CF I（m）59相互作用在剪接和3'末端处理的功能协调中的直接作用。

PubMed免责声明

数字

图1
跨越U2AF 65残基17-47的区域对于促进体外HeLa细胞核提取物中的3′端断裂。(A类)U2AF 65蛋白的结构域组织图显示了一个中心U2AF 35相互作用域（U2AF 35-）和三个羧基末端RRM。显示了本研究中使用的U2AF 65-全长和各种缺失突变体的范围。(B类)体外使用R17-腺病毒L3 RNA切割底物的切割反应。³²在各种R17-U2AF 65融合蛋白（3–8道）或R17蛋白（14 pmol）（9道）数量增加的情况下，用HeLa核提取物（2–9道）培养P标记的RNA底物。通道1对应于输入RNA。未分离和裂解产物的标识显示在左侧。(C类)体外裂解反应。R17-腺病毒L3³²在各种R17-U2AF 65融合蛋白（通道2-5）或R17蛋白（14 pmol）（通道6）的增加量（7或14 pmol。未切割和切割产品的标识显示在左侧。这些具有代表性的实验至少重复了六次。将所有添加的融合蛋白的数量增加到30 pmol并没有进一步激活3′端切割的效率，这表明添加的蛋白达到14 pmol时，刺激效果最大。由劈开产物与未劈开产物之比确定的劈开百分比在面板B和C的直方图上表示(D类)过滤结合分析；过滤结合RNA的归一化分数与蛋白质浓度成函数关系。对三个独立实验的平均数据点进行曲线拟合。星号表示裂解产物的迁移位置。

图2
位于U2AF残基30和47之间的富含RS-的区域足以促进体外HeLa细胞核提取物中的裂解，而含有5或7个RS重复的肽不会刺激裂解。(A类)该区域的氨基酸序列位于U2AF 65的残基17和47之间。(B类–D类)体外使用R17-腺病毒L3（B，D）或R17-β-珠蛋白（C）RNA裂解底物的裂解反应。³²在不存在R17蛋白（B和D组的第1通道；C组的第2通道）或R17蛋白数量增加（7或14 pmol）的情况下，用HeLa核提取物培养P标记的RNA底物（B组的第10-11通道和C组的13-14通道），如图所示的各种R17-U2AF 65融合蛋白（B组的2–9条通道和C组的3–12条通道）或含有五或七个RS二肽的R17融合蛋白（D组的2-5条通道）。未剥离和劈开产品的标识显示在放射自显影图的左侧。由劈开产物与未劈开产物之比确定的劈开百分比在面板B和C的直方图上表示。这些代表性实验至少重复了五次。将所有添加的融合蛋白的数量增加到30 pmol并没有进一步激活3′端切割的效率，这表明添加的蛋白达到14 pmol时，刺激效果最大。星号表示裂开产品的迁移位置。

图3
U2AF 65提高了3′端解理速率，减少了解理反应的滞后相。时间进程体外在R17蛋白或R17-U2AF 65（1-85）融合蛋白存在下，使用HeLa细胞核提取物对R17-腺病毒L3 RNA裂解底物进行裂解反应。每个时间点的解理百分比由解理产物与未解理产物的比率绘制在图表上。这些具有代表性的实验被重复至少三次。星号表示裂开产品的迁移位置。

图4
U2AF 65与CF I的59kDa亚单位相互作用_米. (A类)体外使用GST下拉分析蛋白质-蛋白质相互作用。指示的GST融合蛋白（GST-R17、GST-R17-U2AF 65和GST-R17-U2AF 65（1-85））与谷胱甘肽琼脂糖珠结合，并用于与³⁵CF I的59和68 kDa亚基的S-蛋氨酸标记结构域_米如图所示。加载了10%的输入。(B类)CF I 59 kDa亚基的域组织图解_米包含氨基末端RRM、中心富含脯氨酸结构域（PRO）和羧基末端类RS-交替电荷结构域（RS）。所有GST下拉实验至少进行了三次，以确保再现性。(C类)体内利用酵母双杂交实验进行蛋白质-蛋白质相互作用分析。用编码所示蛋白质的质粒组合转化酵母，并在Leu上生长⁻Trp公司⁻评估β-半乳糖苷酶活性之前的培养基。

图5
U2AF 65招募CF I_米59到腺病毒L3裂解/多聚腺苷化位点。(A类)（i）重组CF i的考马斯蓝染色_米^59/25复杂。M：蛋白质标记物。（ii）使用针对CF I的抗体进行免疫印迹_米68.NE：核提取物。（B，C）UV交联实验使用均匀的³²P标记的R17-腺病毒L3 RNA底物(B类)或均匀³²P标记的R17-β-珠蛋白RNA底物(C类). 标记的RNA与CF I孵育_米^59/25各种R17-U2AF 65融合蛋白的8 pmol缺失（B、C、1道）或存在（B、C、2-5道）时（6 pmol）。培养后，进行交联，并通过SDS-PAGE解析交联多肽。这个实验至少进行了四次。交联反应迁移质量差是由于反应中存在聚乙烯醇。(D类)（i）A³²含有腺病毒I主要晚期内含子上游的3′剪接位点的P标记RNA（PYR），位于腺病毒L3多聚腺苷化位点（见Vagner等，2000）和³²在HeLa核提取物中培养八种尿苷突变为腺嘌呤的P标记RNA（无PYR-less），并通过紫外线辐射交联。交联多肽要么通过SDS-PAGE（ii）直接分离，要么在用针对U2AF 65（Gama-Carvalho）的MC3单克隆抗体分离之前进行免疫沉淀等（iii，车道1和2）或抗CF I的多克隆抗体_米（iv，车道1和2）。用于免疫沉淀的模拟柱显示在图（iii）和（iv）泳道3中，并且显示在37kDa迁移的蛋白质的非特异性免疫沉淀(^*).

图6
U2AF 65和CF I之间的相互作用_米^59/25促进多聚腺苷化。(A类)使用HeLa细胞核提取物（NE）进行多聚腺苷酸化分析。³²在HeLa核提取物中孵育含有AAUAAA（1–5道）或AAGAAA（6–10道）序列的P标记预分离R17-腺病毒L3 RNA底物，无需（2道和7道）或添加R17（5道和10道）或R17-U2AF 65（1–85）融合蛋白（3、4和8、9道），如上所示。通道1和通道2是输入RNA。聚腺苷酸化反应是在镁的存在下进行的²⁺（1-5车道）或Mn²⁺（6–10车道）。在6%（19:1）变性PAGE凝胶上分析RNA。（B–D）使用重组PAP、PAPΔC和CF I进行重组聚腺苷酸化分析_米^59/25复合物和腺病毒L3预先分离底物。在所有实验中，在6%（19:1）变性PAGE凝胶上分析RNA。RNA标记的迁移位置显示在左侧。实验至少重复了三次。(B类)在CF I存在的情况下，使用重组PAP（通道2、3和5-7；0.1 pmol）或PAPΔC（通道8–12；0.1 pmole）进行聚腺苷酸化反应_米^59/25R17（通道7和12）或R17-U2AF 65（1-85）融合蛋白（通道3、6、9和11）的复合物（通道4-7和10-12；2pmol）和1pmol。(C类)用腺病毒L3预分离RNA底物和重组PAP（通道2和4-12；0.1 pmol）在CF I存在下进行重组多聚腺苷化分析_米^59/25（3–12道；2 pmol）和所示R17-U2AF 65融合蛋白的减少量（1和0.5 pmol）。箭头：输入RNA(D类)用β-珠蛋白预切割RNA底物和重组PAP（2–10道；0.1 pmol）在CF I存在下进行重组聚腺苷酸化分析_米^59/25（通道2–10；2 pmol）和所示R17-U2AF 65融合蛋白的增加量（0.5和1 pmol）。箭头：输入RNA。

图7
说明了U2AF 65参与拼接和3′端处理耦合的模型。我们建议(A类)U2AF 65结合到最后3′剪接位点的嘧啶束(三′*不锈钢*)前mRNA的链系CF I的59 kDa亚单位_米至切割/聚腺苷酸化位点(*PA公司*)通过这两种蛋白质之间的相互作用（双向箭头）。这导致刺激3′端加工。在(B类)，PAP通过切割/多聚腺苷化复合物招募到RNA与U2AF 65相互作用（Vagner等，2000）帮助将该剪接因子连接到最接近的3′剪接位点，从而刺激剪接。厚黑色通道对应内含子序列，而白色矩形对应前体mRNA的3′末端外显子。

请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

脊椎动物poly（A）聚合酶的羧基末端与U2AF 65相互作用，耦合3’末端加工和剪接。
Vagner S、Vagner C、Mattaj IW。 Vagner S等人。基因开发2000年2月15日；14(4):403-13. 基因开发2000。 PMID：10691733 免费PMC文章。
与U2AF（35）相关的剪接因子U2AF（6）的特征。
Shepard J、Reick M、Olson S、Graveley BR。 Shepard J等人。摩尔细胞生物学。2002年1月；22(1):221-30. doi:10.1128/MCB.22.121-230.2002。摩尔细胞生物学。2002 PMID：11739736 免费PMC文章。
异二聚体剪接因子U2AF的RNA结合活性：高亲和力结合需要至少一个RS结构域。
Rudner DZ、Breger KS、Kanaar R、Adams MD、Rio DC。 Rudner DZ等人。摩尔细胞生物学。1998年7月；18(7):4004-11. doi:10.1128/MCB18.7.4004。摩尔细胞生物学。1998 PMID：9632785 免费PMC文章。
人类切割因子I（m）的结构暗示了UGUA特异性RNA结合以外的功能：在选择性聚腺苷酸化中的作用以及与5'覆盖和剪接的潜在联系。
Yang Q，Gilmartin GM，DoubliéS。杨强等。 RNA生物学。2011年9月至今；8(5):748-53. doi:10.4161/rna.8.5.16040。Epub 2011年9月1日。 RNA生物学。2011 PMID：21881408 免费PMC文章。审查。
在3'-末端形成中剪接的一种积极作用。
马丁森HG。马丁森HG。 Wiley Interdiscip Rev RNA.2011年7月至8月；2(4):459-70. doi:10.1002/wrna.68。Epub 2010年12月16日。 Wiley Interdiscip-RNA修订版，2011年。 PMID：21957037 审查。

查看所有类似文章

引用人

死盒ATP酶Dbp2是基因3'末端mRNP组装检查点的关键酶，参与切割因子的循环。
Aydin E、Schreiner S、Böhme J、Keil B、Weber J、Juunar B、Glatter T、Kilchert C。 Aydin E等人。国家公社。2024年8月9日；15(1):6829. doi:10.1038/s41467-024-51035-z。国家公社。2024 PMID：39122693 免费PMC文章。
3'-UTR发夹的功能分析支持转录后调控的双层模型MAT2A公司METTL16。
Hunter OV、Ruiz JC、Flaherty JN、Conrad NK。 Hunter OV等人。 RNA。2023年11月；29(11):1725-1737. doi:10.1261/rna.079695.123。Epub 2023年8月11日。 RNA。2023 PMID：37567786
重链内含子的相互作用影响有效的转录剪接，并影响来自CHO细胞的重组生物治疗抗体的产品质量。
Kelsall E、Harris C、Sen T、Hatton D、Dunn S、Gibson S。 Kelsall E等人。 MAbs公司。2023年1月至12月；15(1):2242548. doi:10.1080/19420862.2023.2242548。 MAbs公司。2023 PMID：37555672 免费PMC文章。
前mRNA剪接及其共转录连接。
Shenasa H、Bentley DL。 Shenasa H等人。趋势Genet。2023年9月；39(9):672-685. doi:10.1016/j.tig.2023.04.008。Epub 2023年5月24日。趋势Genet。2023 PMID：37236814 免费PMC文章。审查。
两个拟南芥剪接因子U2AF65a和U2AF650b通过调节一个子集的表达或选择性剪接来差异控制开花时间FLC公司上游调节器。
Lee HT、Park HY、Lee KC、Lee JH、Kim JK。 Lee HT等人。工厂（巴塞尔）。2023年4月14日；12(8):1655. doi:10.3390/plants12081655。工厂（巴塞尔）。2023 PMID：37111878 免费PMC文章。

查看所有“被引用”文章

工具书类

1. Antoniou M，Geraghty F，Hurst J，Grosveld F（1998）人体β-珠蛋白mRNA在体内的有效3′端形成需要最后一个内含子内的序列，但与剪接反应无关。核酸研究26:721–729-项目管理咨询公司-公共医学
1. Bauren G，Belikov S，Wieslander L（1998）Balbiani环1基因的转录终止与3′末端内含子的形成和切除密切相关。基因Dev 12:2759–2769-项目管理咨询公司-公共医学
1. Beaudoi E，Gautheret D（2001）使用EST数据识别交替聚腺苷化位点并分析其组织分布。基因组研究11:1520–1526-项目管理咨询公司-公共医学
1. Berget SM（1995）脊椎动物剪接中的外显子识别。生物化学杂志270:2411–2414-公共医学
1. Blanchette M、Labourier E、Green RE、Brenner SE、Rio DC（2004）基因组分析揭示了果蝇剪接因子U2AF50在无内含子mRNA核输出中的意外功能。分子细胞14:775–786-公共医学

出版物类型

行动

MeSH术语

行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动

LinkOut-更多资源

[1] Antoniou M，Geraghty F，Hurst J，Grosveld F（1998）人体β-珠蛋白mRNA在体内的有效3′端形成需要最后一个内含子内的序列，但与剪接反应无关。核酸研究26:721–729-项目管理咨询公司-公共医学

[2] Antoniou M，Geraghty F，Hurst J，Grosveld F（1998）人体β-珠蛋白mRNA在体内的有效3′端形成需要最后一个内含子内的序列，但与剪接反应无关。核酸研究26:721–729-项目管理咨询公司-公共医学

[3] Bauren G，Belikov S，Wieslander L（1998）Balbiani环1基因的转录终止与3′末端内含子的形成和切除密切相关。基因Dev 12:2759–2769-项目管理咨询公司-公共医学

[4] Bauren G，Belikov S，Wieslander L（1998）Balbiani环1基因的转录终止与3′末端内含子的形成和切除密切相关。基因Dev 12:2759–2769-项目管理咨询公司-公共医学

[5] Beaudoi E，Gautheret D（2001）使用EST数据识别交替聚腺苷化位点并分析其组织分布。基因组研究11:1520–1526-项目管理咨询公司-公共医学

[6] Beaudoi E，Gautheret D（2001）使用EST数据识别交替聚腺苷化位点并分析其组织分布。基因组研究11:1520–1526-项目管理咨询公司-公共医学

[7] Berget SM（1995）脊椎动物剪接中的外显子识别。生物化学杂志270:2411–2414-公共医学

[8] Berget SM（1995）脊椎动物剪接中的外显子识别。生物化学杂志270:2411–2414-公共医学

[9] Blanchette M、Labourier E、Green RE、Brenner SE、Rio DC（2004）基因组分析揭示了果蝇剪接因子U2AF50在无内含子mRNA核输出中的意外功能。分子细胞14:775–786-公共医学

[10] Blanchette M、Labourier E、Green RE、Brenner SE、Rio DC（2004）基因组分析揭示了果蝇剪接因子U2AF50在无内含子mRNA核输出中的意外功能。分子细胞14:775–786-公共医学

将引文保存到文件

电子邮件引文

添加到集合

添加到我的书目

您保存的搜索

为外部引文管理软件创建文件

您的RSS源

U2AF 65和CF I（m）之间的相互作用连接了拼接和3'端加工机械

附属

U2AF 65和CF I（m）之间的交互将拼接和3’端加工机械连接起来

作者

附属

摘要

数字

类似文章

引用人

工具书类

出版物类型

MeSH术语

物质

LinkOut-更多资源

全文源

其他文献来源

分子生物学数据库

摘要

数字

类似文章

引用人

工具书类

出版物类型

MeSH术语

物质

相关信息

LinkOut-更多资源

全文源

其他文献来源

分子生物学数据库