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.2006年12月；17(12):5053-62.
doi:10.1091/mbc.e06-06-0571。 Epub 2006年10月4日。

WD重复蛋白IFTA-1是逆行鞭毛内转运所必需的

奥利弗·布拉克 1, 李春梅, 彼得·英格里斯, Muneer A电子邮件, 广硕欧, 艾伦·K·马, 大卫·L·贝利, 乔纳森·斯科利, 米歇尔·勒鲁
附属公司

WD重复蛋白IFTA-1是逆行鞭毛内转运所必需的

奥利弗·布拉克等。 分子生物学细胞. 2006年12月.

摘要

纤毛的组装和维持需要鞭毛内运输（IFT），这是一种微管依赖的多亚单位蛋白复合物沿纤毛轴突的双向运动。IFT和运动或感觉纤毛功能的缺陷与许多人类疾病有关，包括多囊肾病和Bardet-Biedl综合征。在这里，我们鉴定了一种新的秀丽隐杆线虫IFT基因，即IFT相关基因1（ifta-1），它编码一种含有WD重复序列的蛋白质，与一种功能未知的哺乳动物蛋白质具有强同源性。秀丽隐杆线虫和人IFTA-1蛋白均定位于纤毛基底部，在秀丽隐柄线虫中可以观察到IFTA-1经历IFT。纤毛的功能和组装需要IFTA-1，因为秀丽线虫IFTA-1突变株表现出化学感觉异常和纤毛缩短，核心IFT机械部件的纤毛堆积突出，表明存在逆行运输缺陷。线虫IFTA-1沿着bbs突变纤毛的定位/运动分析表明，IFTA-1与IFT颗粒a亚复合物密切相关，这与逆行IFT有关。总之，我们的数据表明IFTA-1是一种新的IFT蛋白，是沿睫状轴突逆行运输所必需的。

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图1。
图1。
ifta-1型（C54G7.4）是一个包含X-box的基因，在纤毛生物中是保守的。（A） RFX转录因子结合X盒位于ifta-1型在里面秀丽线虫,C.布里格斯、和智人（B）IFTA-1蛋白示意图，该蛋白由1199个氨基酸组成（in秀丽线虫)并被预测具有三个WD蛋白基序。（C） IFTA-1同系物氨基酸同源性百分比的交叉谱比较秀丽线虫,智人,小家鼠、河豚鱼、，黑腹果蝇,C.莱因哈迪,布氏锥虫、和草履虫属注意，IFTA-1同源物不存在于非融合生物体中，例如拟南芥和酿酒酵母.
图2。
图2。
IFTA-1定位于秀丽线虫哺乳动物肾细胞的基底体/中心体区域。（A和B）GFP标记的IFTA-1特异性定位于纤毛的基部（过渡区或基体）和沿着秀丽线虫纤毛神经元。所示为线虫尾部（A）中的一组有相神经元和线虫头部（B）中的一组两片纤毛的荧光图像，显示了细胞体（cb）、树突（den）、过渡区（tz）和纤毛轴突（cil）。（C） GFP标记智人IFTA-1定位于哺乳动物肾细胞的基底体和中心体。显示了ICMD3细胞表达智人 ifa1:：gfp转基因。顶部，内源性γ微管蛋白和乙酰化α微管蛋白抗体分别检测中心体/基底体（红色，支架）和睫状轴索（红色，箭头）。中间，GFP标记的IFTA1显示点状荧光（括号），与它在基底体和中心体的定位一致。底部合并的红色和绿色荧光图像显示基底体/中心体和GFP标记的IFTA1（黄色，括号）的共定位。
图3。
图3。
秀丽线虫IFTA-1经历双相IFT。（A） GFP标记的IFTA-1进行IFT。图中显示的是一个波形图（连续3个0.5秒的时间点），描绘了GFP标记的IFTA-1相关粒子（箭头）沿着一个相移神经元的睫状轴丝的顺行运动（远离过渡区，tz）。比例尺显示在日程表的底部。（B和C）IFTA-1的顺行IFT运动是双相的。图B所示为代表性的“静止”荧光图像以及相应的波形图（M和D）和波形图示意图（M′和D′），这些图像是通过分析IFTA-1:：GFP沿两栖感觉纤毛的转运（使用IFT运动分析）获得的。请注意，测波仪的单个对角线对应于单个荧光粒子的运动速率。图像（B）和表（C）显示，在野生型纤毛中，GFP标记的IFTA-1显示双相IFT，中间段（M和M′）有中等速度，远端段（D和D′）有快速速度。还显示了IFTA-1:：GFP在异源三聚体驱动蛋白II亚基基因发生功能丧失突变的动物的睫状轴突上的单相IFT行为，klp-11型和同二聚体OSM-3-驱动蛋白亚基基因，渗透压-3.
图4。
图4。
ifta-1型是感觉纤毛正常结构和功能所必需的纤毛生成基因。（A） 两个突变等位基因的产生ifta-1型通过转座子切除。所示为cxP5003:：Tc1在ifta-1型以及切除后得到的600和2009碱基对缺失。（B）ifta-1（nx61）与野生型（N2）动物相比，突变体对异戊醇的趋化性有缺陷。在ifta-1（nx61）表达野生型的蠕虫ifa-1:：gfp转基因。（C）ifta-1（nx34）和ifta-1（nx61）动物吸收荧光染料DiI的能力有缺陷。所示为野生型和ifta-1型染料填充试验后的突变蠕虫。请注意ifta-1型变种人在ifta-1型表达野生型的突变体ifa-1:：gfp转基因。（D） Dyf表型ifta-1（nx61）突变体在所有幼虫和成虫阶段都是完全渗透的，而ifta-1（nx34）动物具有阶段特异性Dyf表型。注意，每个数据点代表50个蠕虫的分析。（E和F）ifta-1（nx61）突变体比野生型蠕虫短，但比野生型线虫长渗透压-3（p802）突变体。给出了荧光图像（E）和图表（F），显示了通过使用srb-6p:：gfp和gcy-5p:：gfp记者。E:Bar，2μm；恒星、过渡带；托槽，纤毛。F的n值显示在括号中。
图5。
图5。
ifta-1型突变体的逆行性IFT缺陷支票-11突变体。（A和B）顺行性IFT机制，即驱动蛋白-2马达（A）和IFT-B亚复合蛋白（B），沿着ifta-1型和车-11变异纤毛。所示为野生型（N2）一组角质纤毛的代表性荧光图像，ifta-1（nx61）、和车-11（e1810）表达所示GFP标记蛋白的动物。图像显示，与野生型蠕虫相比，顺行性IFT运动亚单位（KAP-1：：GFP和OSM-3：：GFP）和IFT-B亚复合蛋白（OSM-1：：绿色荧光蛋白、OSM-6：：绿色绿色荧光蛋白和CHE-2：：绿色荧光素酶）在ifta-1型和车-11突变体，表明逆行IFT缺陷。请注意，在野生型面板中，表示了睫状轴突（ax）、过渡区（tz）和树突（d）。还请注意，所有图像的大小和方向都类似，所有面板中的过渡区区域都用括号表示。（C） 荧光IFT蛋白沿WT角状纤毛的顺行IFT运动速度，ifta-1（nx61）和车-11（e1810)突变体。星号表示与野生型纤毛相比，可检测到的顺行运输事件的数量ifta-1（nx61）、和车-11（e1810）突变体纤毛较低；因此，只能获得较小的n值。参考（Ref.）指雪地等。（2004）OSM-6:：GFP，Ou等。（2005a），针对KAP-1:：GFP、OSM-3:：GFF、CHE-2:：GFG和CHE-11:：GFP，以及Ou和Scholey，针对OSM-1:：GFP的未发布数据。
图6。
图6。
IFTA-1是一种IFT颗粒亚复合物A型蛋白。（A和B）与野生型（N2）纤毛不同论坛突变纤毛，IFTA-1:：GFP仅以非偶联驱动蛋白II/IFT-A亚复合物组合的特征慢速率沿中段（M和M′）移动，不进入远端。图A所示为代表性静止荧光图像以及对应的波形图（M）和波形图示意图（M′），这些图像是通过分析IFTA-1沿野生型（N2）的转运（使用IFT运动分析）获得的，bbs-8（nx77）、和锇-12（n1606）变异纤毛。所有图像的大小和方向相似，所有面板中都显示了过渡区和睫状轴突。（C） IFTA-1的睫状体定位需要CHE-11蛋白功能，反之则不需要。显示的是代表性的静止荧光图像和相应的频谱图（M）和频谱图示意图（M′），这些图像是通过分析CHE-11：：GFP的IFT（通过使用IFT运动测定法）获得的ifta-1（nx61）突变体和IFTA-1:：GFP车-11（e1810）突变体。请注意，CHE-11:：GFP在ifta-1型突变体。相反，IFTA-1:：GFP不进入车-11变异纤毛。两幅图像的大小和方向都相似，两幅图像中都显示了过渡区和睫状轴索。
图7。
图7。
IFTA-1模型是逆行性IFT的一个组成部分。展示的是Snow先前模型的扩展等。（2004）和欧等。（2005a），其中显示两个驱动蛋白-2马达驱动顺行IFT（异三聚体驱动蛋白II，棕色；同二聚体OSM-3-驱动蛋白，蓝色），发现BBS-7和BBS-8蛋白稳定IFT-A和IFT-B亚复合物的结合。（A） IFTA-1功能丧失导致IFT机械成分的睫状体堆积，包括IFT-B亚复合物和IFT-A亚复合物蛋白（CHE-11），表明IFTA-1功能不是通过顺行IFT进入纤毛的IFT机械组件所必需的，而是通过逆行IFT将IFT机械回收回纤毛基底所必需的。逆行IFT缺陷导致单微管源性远端部分缺失。（B） IFT-A亚复合物基因突变车-11近距离观察到的逆行性IFT缺陷ifta-1型突变体。此外，IFTA-1蛋白的睫状体定位需要CHE-11功能。（C） A和B中的数据表明，在野生型秀丽线虫感觉纤毛，IFTA-1与IFT-A亚复合物和IFT逆行臂内的功能密切相关。
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