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.2006年10月；26(19):7116-29.
doi:10.128/MCB.00268-06。

DACH1是一种抑制细胞周期蛋白D1和乳腺癌生长的细胞命运决定因子

吴孔明博士 1, 李安平, 马哈德夫·拉奥, 刘满然, 弗农·戴利, 杨莹, 多洛雷斯·迪维齐奥, 王晨光同学, 迈克尔·P·利桑蒂, 吉多·索特, 罗伯特·罗素, Ales Cvekl公司, 理查德·佩斯特尔
附属机构

DACH1是一种抑制细胞周期蛋白D1和乳腺癌生长的细胞命运决定因子

吴孔明博士等。 分子细胞生物学. 2006年10月.

摘要

具有增殖潜能的细胞扩张的障碍包括诱导细胞死亡、端粒衰老以及pRb和p53肿瘤抑制剂。调控肿瘤发生的分子途径经常会重述调控胚胎发生过程的异常。由腊肠（dac）、缺眼（eya）、无眼和无眼（so）基因组成的遗传网络调节后生动物的细胞命运决定，dac通过so-DNA结合因子充当协整器。在这里，DACH1抑制癌基因介导的乳腺癌发生，阻断小鼠乳腺癌上皮细胞DNA合成、集落形成、Matrigel生长和肿瘤生长。基因缺失研究表明，DACH1介导的DNA合成抑制需要细胞周期蛋白D1。DACH1通过一种新的机制通过c-Jun DNA结合伴侣抑制细胞周期蛋白D1，需要DACH1α螺旋DS结构域将辅压因子募集到局部染色质。对2000多名患者的分析表明，细胞核DACH1的表达增加与细胞有丝分裂呈负相关，并预测乳腺癌患者的生存率会提高。细胞命运决定因子DACH1阻止乳腺肿瘤在体内的增殖和生长，为这一常见疾病提供了新的机制和潜在的治疗见解。

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数字

图1。
图1。
可诱导的DACH1表达抑制体内集落形成和肿瘤生长。（A） 对MDA-MB-231稳定磷甾酮诱导的DACH1细胞系中DACH1的Flag表位进行免疫组织化学染色，显示与DAP1染色的核共定位。（B） 将泊那甾酮诱导的MDA-MB-231稳定细胞接种到六孔板上，生长14天后用结晶紫染色。菌落体积（平均值±平均值的标准误差[SEM]，单位：mm三)如右侧所示（*，P（P）< 0.01). （C） 磷甾酮诱导MDA-MB-231稳定细胞在裸鼠体内的肿瘤生长(n个>每组12只单独的动物；*，P（P）< 0.05). 用磷甾酮A微丸或对照微丸（载体）治疗小鼠，每周评估肿瘤大小。（D） 用载体或磷甾酮A微丸处理的动物的DACH1诱导MDA-MB-231细胞的代表性Western blot分析。
图2。
图2。
DACH1通过DS结构域抑制DNA合成。（A） 表达可诱导DACH1的MDA-MB-231细胞被鉴定为DACH1表达对血清诱导的DNA合成的影响。用Sub-G评估DACH1表达对S期或凋亡的影响1（B） 加入血清18小时后显示annexin V染色（C）。数据为5个以上单独实验的平均值±SEM。（D） DACH1表达载体的示意图。（E） 转染DACH1表达载体的MCF-7细胞的细胞周期分析。与矢量控制相比，显示了S期MCF-7细胞的百分比。数据是DACH1转染MCF-7细胞S期±SEM的平均变化(n个= 4). （F） 磷甾酮A及相应的细胞周期蛋白D1和p21对DACH1的剂量依赖性诱导CIP1级在MDA-MB-231细胞中表达。（G） 通过Western blotting法测定普那司酮A处理48小时后MDA-MB-231细胞中细胞周期相关蛋白的丰度。
图3。
图3。
DACH1抑制NeuT、Ras/ErbB2或Myc诱导的DNA合成。（A） 用NeuT、Ras/ErbB2或c-Myc转化永生化MCF10A细胞。用MSCV-IRES-GFP或MSCV-DACH1-IRES-GFF转导细胞，并通过GFP-FACS筛选细胞进行分析。通过相比较和腺泡结构的荧光显微镜，描述了Matrigel在10天时的三维生长形态。（B） 固定后GFP和溴化乙锭染色的共聚焦图像。转化的MCF10A细胞生长为实心球，其中中心腺泡结构充满增殖细胞。DACH1的表达恢复了致癌形态，恢复了未转化的MCF10A表型，具有极化上皮和腺泡样管腔结构。（C和D）细胞周期分布。（E至G）集落形成分析结果（E）和细胞周期控制蛋白，通过对转化的MCF10A细胞和指示抗体（F和G）进行Western blotting测定。
图4。
图4。
DACH1抑制DNA合成需要cyclin D1。（A至F）DACH1通过FACS分析（A至C和F）或DNA合成调节细胞周期分布[三H] 用annexin V染色法对来自小鼠MEF的3T3细胞的胸腺嘧啶核苷摄取（D）和凋亡细胞周期蛋白D1（A至E）或第21页CIP1级或第27页知识产权1（F） 与具有相同菌株背景的同胞对照相比，基因被删除。使用用MSCV-IRES-GFP或MSCV-DACH1-IRES-GFP转导的细胞通过GFP-FACS分选来评估细胞周期分布。Western blotting证实DACH1的表达，GDI作为负荷控制（参见补充材料中的图S2）。（G）细胞周期蛋白D1+/+用编码Flag表位标记的细胞周期蛋白D1或DACH1的表达载体转导细胞。Western blot分析显示DACH1和cyclin D1表达。FACS分析表明，细胞周期蛋白D1可缓解DACH1对DNA合成的抑制。
图5：。
图5：。
DACH1在局部染色质的背景下将HDAC招募到细胞周期蛋白D1启动子的AP-1/CRE位点。（A） 用DACH1或对照siRNA处理MCF-7细胞，检测内源性cyclin D1蛋白丰度和cyclin D1mRNA水平；GDI被用作Western blot分析的加载控制，18S RNA被用作Northern blot分析中的加载控制。（B） 在转染DACH1 siRNA的MCF-7细胞中评估Cyclin D1启动子活性。启动子活性显示为六个单独转染的平均值±SEM。（C） DACH1 siRNA转染MCF-7细胞的平均S期分析。用编码DACH1的表达载体或MCF-7细胞中DS结构域缺失（ΔDS）的DACH1突变体转染细胞中的（D和E）Cyclin D1启动子活性。矢量控制值设置为100。比较细胞周期蛋白D1启动子点突变体对DACH1的抑制作用。数据（平均值±SEM）显示为与八个单独实验的矢量相比的阻遏百分比。（F和G）对编码与荧光素酶报告基因相关的细胞周期蛋白D1 AP-1和CRE位点的异源报告基因进行评估，以了解DACH1对3T3细胞的调节。（H） 使用指向内源性人类细胞周期蛋白D1启动子AP-1或CRE位点的DNA序列或位于−3060的控制DNA序列的寡核苷酸进行ChIP分析。显示用PonA或载体处理表达可诱导标记DACH1的MDA-MB-231细胞。（一） 用−1745 cyclin D1启动子和标记的野生型或突变DACH1表达载体共同转染293T细胞。ChIP分析使用指向人类细胞周期蛋白D1 AP-1或CRE位点DNA序列的寡核苷酸进行。（J） 对内源性DACH1与人类细胞周期蛋白D1启动子结合的ChIP分析，比较−3060区域（阴性）和细胞周期蛋白D2启动子AP-1位点。（K） 用对照或DACH1或Ski表达载体转染293T细胞，通过Western blotting检测c-Jun和CREB。使用针对DACH1、ΔDS和Ski表达载体的Flag表位的抗体进行免疫沉淀，并对c-Jun或CREB进行免疫沉淀分析。
图6。
图6。
DACH1在人类乳腺癌细胞系、小鼠乳腺和乳腺癌组织中的表达。（A） 用对照或DACH1表达载体瞬时转染293T细胞，并用DACH1特异性抗体进行Western blotting分析。（B） Western blot检测DACH1丰度的乳腺上皮细胞系、乳腺癌细胞系和转染DACH1的293T细胞的对照提取物（通道1）。GDI被用作加载控制。（C） DACH1在小鼠胚胎眼中的表达作为阳性对照。（D） 处女、怀孕（第10天）、哺乳（第10天）和退化（第10天后）小鼠乳腺发育期间的DACH1免疫组织化学。（E） 使用DACH1特异性抗体在正常乳腺上皮、原位导管癌或侵袭性人类乳腺癌样本中的代表性DACH1表达。（F） 人类乳腺组织芯片亚类中DACH1表达的分析（*，P（P）< 0.05). （G） DACH1表达与有丝分裂指数的关系。（H） 乳腺癌中DACH1的表达与预后(n个=2125名患者）。
图7。
图7。
DACH1和细胞周期蛋白D1的相对表达。（A） 配对乳腺癌组织中cyclin D1和DACH1的代表性免疫染色。（B） 乳腺癌细胞周期蛋白D1和DACH1的负相关(n个= 46).
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