Hippocampal neurons recycle BDNF for activity-dependent secretion and LTP maintenance

doi:10.1038/sj.emboj.7601303

.2006年9月20日；25(18):4372-80.

doi:10.1038/sj.emboj.7601303。 Epub 2006年9月7日。

海马神经元循环BDNF进行活性依赖性分泌和LTP维持

斯巴达克·桑蒂¹, 西尔维娅·卡佩罗, 马西莫·里奇奥, 马泰奥·贝加米, 乔治·艾卡迪, 乌苏拉·申克, 米歇拉·马特奥利, 马可·卡诺萨

附属公司

PMID： 16957779
预防性维修识别码：项目经理1570444
内政部： 10.1038/sj.emboj.7601303

海马神经元循环BDNF进行活性依赖性分泌和LTP维持

斯巴达克·桑蒂等。欧洲工商管理硕士J. 2006.

.2006年9月20日；25(18):4372-80.

doi:10.1038/sj.emboj.7601303。 Epub 2006年9月7日。

作者

斯巴达克·桑蒂¹, 西尔维娅·卡佩罗, 马西莫·里奇奥, 马泰奥·贝加米, 乔治·艾卡迪, 乌苏拉·申克, 米歇拉·马特奥利, 马可·卡诺萨

附属

¹CNR-ITOI/ISMN，意大利博洛尼亚。

PMID： 16957779
预防性维修识别码：项目经理1570444
内政部： 10.1038/sj.emboj.7601303

摘要

脑源性神经营养因子（BDNF）分泌的调节在长时程增强（LTP）中起着关键作用。一般认为，这种分泌物的供应是针对突触新合成的BDNF。在这里，我们提供了证据，证明海马神经元额外循环BDNF进行活动依赖性分泌。外源性应用的BDNF被培养的神经元内化，并迅速可用于活性依赖性分泌，这是由调节新合成的BDNF分泌的相同机制控制的。此外，BDNF循环取代了新的合成途径，在海马脑片中调节LTP的维持：晚期LTP被蛋白质合成抑制所消除，在预先培养BDNF的脑片中被挽救。因此，内吞的BDNF被反馈回LTP维护所需的活性相关释放池。

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数字

图1
TrkB介导的BDNF在培养海马神经元中的内吞作用。(A类)未经处理的神经元（0分钟）或在K252a预处理存在或不存在的情况下暴露于BDNF的神经元（10和60分钟）中BDNF内吞作用的时间进程，通过免疫细胞化学获得并通过共焦显微镜分析。图像代表了在四个独立实验中分析的50个神经元。棒材，20μm。(B类)BDNF对TrkB质膜表达的调节。用琼脂糖结合链霉亲和素（IP Strept）沉淀法从对照神经元或经BDNF处理的神经元的裂解液中分离出标记有活性生物素的质膜蛋白。Western blot分析表明，BDNF可降低TrkB，但不降低TrkB-t；用K252a预处理神经元可阻止这种效应。WGA-琼脂糖（IP WGA）沉淀的糖结合蛋白显示全细胞裂解液中TrkB和TrkB-t的总量。(C类)通过ELISA在与面板B.a.w.相同的裂解液中测量的外源性BDNF的细胞内积累表明通过酸处理从细胞表面剥离的BDNF免疫反应量。数据表示为平均值±标准误差的百分比(n个=6).

图2
BDNF–TrkB复合物在内吞囊泡中的内化。(A类)用涂有pan-Trk抗体的磁珠从暴露于外源性BDNF的海马神经元捕获含Trk的小泡。使用抗TrkB抗体的蛋白质印迹分析显示，纯化的囊泡将TrkB表达为135kDa的单一免疫反应蛋白。(B类)酶联免疫吸附试验（ELISA）定量检测pan-Trk珠和反定型珠纯化中的BDNF。数据为平均值±标准误差(n个=4). (C类)用pan-Trk珠分离的囊泡的定量。暴露BDNF 60分钟后，囊泡数量增加。电子显微镜获得的典型图像显示，内吞囊泡附着在pan-Trk珠上。(天)用反型珠分离的囊泡的定量。暴露BDNF 60分钟后，囊泡数量没有变化。电子显微镜获得的典型图像显示，囊泡大小与连接在反定型珠上的突触囊泡的典型大小相同。条形，100 nm。面板C和D中的数据为平均值/100珠子±标准偏差。

图3
内吞和新合成BDNF的细胞内定位。(A类)在存在或不存在TrkB-Fc的情况下，用转导BDNF-myc的腺病毒载体感染海马神经元12小时，用BDNF-YFP孵育10或60分钟。YFP荧光（绿色）和myc免疫荧光（红色）在细胞体（CB）和神经元突起中显示出明显的细胞内定位（箭头）。图像代表了五个独立实验中分析的25个神经元。BDNF-YFP之间的Colocalization(B类)或BDNF myc(C类)EEA1、BiP和GM130的免疫反应（绿色）（红色）。图像代表了在三个独立实验中分析的20个神经元。棒材，20μm。

图4
内吞BDNF的活性依赖性分泌。(A类)通过延时共聚焦成像分析1–6个圆形区域的BDNF-YFP分泌（相位对比）。荧光强度表示为灰度百分比，并随时间绘制。在静息状态下，荧光不变，而KCl处理诱导区域1、4和6减少。共聚焦图像记录KCl处理前（min 4）和处理后（min 8）以假彩色（左侧刻度盘）显示的荧光强度。区域1的三倍放大（插图）显示神经元过程中的BDNF-YFP荧光。请注意，荧光在白色圆圈内减少，而在由红色方块分隔的周围区域内没有增加。这表明荧光强度的降低是由于BDNF-YFP的分泌，而不是由于其在*x–y*轴。数据代表了六个独立实验。棒材，20μm。(B类)在与BDNF-YFP孵育3分钟的海马神经元中，通过TIRF成像分析囊泡的胞外融合。序列图像记录了细胞体（CB）中YFP荧光的去猝灭闪光（箭头）和单个神经元的神经元过程（上部序列）或神经元网络（下部序列）。时间表示灌注KCl前后的秒数。棒材，10μm。融合到质膜上的单个囊泡（红色方块）的荧光强度（灰度）的变化。YFP和吖啶橙（AO）荧光是在一个圆形掩模中测量的，该掩模的中心区域为120像素。图上的数字（1-4）对应于右侧以灰色显示的YFP信号的序列图像。相同的序列图像显示YFP（绿色）和吖啶橙（红色）荧光重叠（黄色）。时间表示荧光信号出现（1）、亮度增加和扩散（2）、减少（3）和消失（4）的毫秒数。棒材，2μm。(C类)ELISA定量检测对照神经元或之前用BDNF-YFP处理60分钟的神经元灌流液中的BDNF-YFP。培养的神经元未显示足够量的BDNF或GFP免疫反应性，无法分别用双位点BDNF和GFP ELISA检测到。KCl处理（5分钟）使BDMF-YFP处理神经元的BDNF-YFP-免疫反应性高于基础水平。(天)ELISA定量测定之前接触BDNF 10、30或60分钟的神经元灌流液中的BDNF。KCl处理（5分钟）使BDNF免疫反应性高于基础水平，并通过K252a预处理加以阻止。面板C中的数据(n个=5）和D(n个=8）为平均值±标准误差。

图5
内吞性BDNF分泌的药理学。(A类)通过ELISA对之前暴露于BDNF 60分钟的海马神经元灌流液中BDNF的分泌进行评估。谷氨酸（Glu）的应用可在含钙和无钙培养基（EGTA）中诱导内源性BDNF分泌。这种作用被BAPTA-AM部分阻止。BDNF的分泌也被咖啡因触发。AMPA-和t-ACPD-诱导的BDNF分泌分别被CNQX和AIDA阻止。无论是否存在APV，NMDA均无效。(B类)NT-4和NT-3可诱导BDNF的分泌，但NGF不诱导。K252a阻止了这种影响。(C类)高频刺激（50 Hz）触发BDNF分泌。TTX阻止了这种影响。(天)给BDNF处理的神经元注射NO供体NOR3后，BDNF分泌减少。相反，KT5823触发BDNF分泌。面板A中的数据(n个=12），B(n个=9），C(n个=12）和D(n个=6）为平均值±标准误差。

图6
内吞BDNF可挽救因蛋白质合成抑制而受损的LTP。(A类)Schaffer络脉刺激在CA1区诱发的场EPSP。TBS诱导的LTP持续180分钟（对照组）（五片，五只大鼠）。在TBS前30分钟至记录结束的用茴香霉素（Aniso）灌注的切片中，LTP仅持续70-100分钟（五片，五只大鼠）。从TBS前5分钟到TBS后15分钟（Aniso+BDNF）（6片，5只大鼠），应用BDNF可完全逆转茴香霉素的作用。(B类)切片培养(*公司前身：Aniso*)并在整个记录过程中用茴香霉素灌注（Aniso），LTP仅持续70-100分钟（9片，7只大鼠）。用BDNF预孵育的切片拯救LTP(*前置：Aniso*+*BDNF公司*)（12片，9只大鼠），TrkB-Fc（Aniso+TrkB-Flc）（8片，6只大鼠。(C类)K252a预处理不影响LTP的维持（对照组；*预inc:K252a*)（10片，7只大鼠）。预孵育液和灌注液中均含有茴香霉素，可将LTP持续时间缩短至70–100分钟（Aniso；*前置：Aniso*+*K252a公路*)（九片，六只大鼠）。茴香霉素对LTP的阻断作用在BDNF和K252a预培养的切片中持续存在（Aniso；*前置：Aniso*+*BDNF公司*+*K252a公路*)（11片，8只大鼠）。(天)用LY294002（LY）预处理（五片，五只大鼠）导致在K252a存在的情况下观察到的相同效果（图C）。面板A-D中的数据是绘制为基线百分比的现场EPSP斜率的平均值±s.e.m。在TBS之前和之后180分钟记录的代表性野外EPSP记录道显示在面板顶部。

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1. Ashby MC、Ibaraki K、Hemley JM（2004）《外面是绿色的：用对pH敏感的GFP追踪细胞表面蛋白质》。《神经科学趋势》27:257–261-公共医学
1. Avery J、Ellis DJ、Lang T、Holroyd P、Riedel D、Henderson RM、Edwardson JM、Jahn R（2000）PC12细胞调节性胞吐的无细胞系统。细胞生物学杂志148:317–324-项目管理咨询公司-公共医学
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