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.2006年11月；26(22):8572-85.
doi:10.1128/MCB.00650-06。 Epub 2006年9月5日。

肾癌ABCG2基因启动子甲基化异常

Kenneth K W收件人 1, Zhang先生, 苏珊·贝茨
附属公司

肾癌中ABCG2基因启动子甲基化异常

Kenneth K W收件人等。 分子细胞生物学. 2006年11月.

摘要

ABCG2是一种普遍存在的ATP-结合盒跨膜蛋白，在临床耐药中起重要作用。目前对ABCG2表达的调控机制知之甚少。我们假设DNA甲基化可能在ABCG2基因表达的表观遗传调控中发挥作用。采用限制性内切酶消化偶联PCR和亚硫酸氢盐基因组测序法检测三种肾癌细胞株启动子甲基化状态。已知VHL启动子甲基化的UOK121和UOK143在5-aza-2'-脱氧胞苷（5-aza-dC）治疗后均显示ABCG2表达诱导，表明ABCG2基因的异常甲基化与基因沉默有关。ABCG2启动子驱动荧光素酶报告载体的体外甲基化导致转录显著抑制。我们的数据表明ABCG2基因在组蛋白和DNA水平上受到协调调控。染色质免疫沉淀分析表明，UOK121和UOK143中的甲基化启动子与甲基CpG结合域蛋白（MBD）、MBD2和MeCP2相关，而UOK181中的非甲基化启动子与之相关。组蛋白去乙酰化酶1和辅抑制剂mSin3A被鉴定与包含CpG岛的启动子区域结合，从而抑制ABCG2转录。ABCG2的活化是通过用5-氮杂-dC（一种去甲基化剂）处理，同时从启动子释放MBD来实现的。此外，5-氮杂-dC处理后，组蛋白H3上甲基化赖氨酸9（启动子甲基化的标志）与启动子的关联减少。这些数据表明，CpG岛中抑制复合物的DNA甲基化依赖性形成有助于ABCG2的失活。

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数字

图1。
图1。
半定量RT-PCR分析（A、C和D）和免疫印迹分析（B和C）ABCG2公司和甚高频在UOK121、UOK143和UOK181细胞中表达。（A） 剂量依赖性上调ABCG2公司用5-aza-dC（1、1.5或2μM）治疗4天后。这些数字表示ABCG2公司和甚高频相对于每个细胞系归一化为β-actin后的未处理样品。（B） 将细胞作为A组处理，并采集用于ABCG2蛋白表达的免疫印迹分析。（C） 细胞未经处理，或用5-氮杂-dC（1μM）处理4天，或用脱肽（2 ng/ml）加维拉帕米（5μg/ml）处理1天。显示了三个独立实验的代表性结果。上部面板显示的是RT-PCR分析ABCG2公司和甚高频数字表明ABCG2公司和甚高频与β-actin正常化后未处理的UOK121细胞相比。琼脂糖凝胶图像ABCG2公司从33周期PCR中提取，以使对应于ABCG2公司在甲基化细胞中。实际定量是用低循环数PCR（25个循环）进行的，之前发现它是线性的。下图表示ABCG2蛋白表达的免疫印迹分析。β-肌动蛋白作为负荷对照。（D） 剂量依赖性上调ABCG2公司用脱肽（1、2、5或10 ng/ml）处理24小时后。数字表示ABCG2公司相对于每个细胞系归一化为β-actin后的未处理样品。
图2。
图2。
甲基化模式ABCG2公司基因。（A） 假定CpG岛的示意图ABCG2公司基因。垂直实线显示的CpG二核苷酸的分布揭示了这些位点在5′侧翼区域的密集聚集，构成了一个CpG岛。CpG岛内的HpaII/MspI识别位点用椭圆表示。双箭头线表示限制性内切酶消化后PCR扩增的区域（远端和近端）。（B） 分别使用HpaII和MspI消化的UOK121、UOK143和UOK181的基因组DNA，使用面板A中显示的引物为ABCG2公司基因。UN，未切割DNA；P、 胎盘DNA。（C） PCR结果与B组相同，使用的引物位于甚高频基因。
图3。
图3。
个体CpG二核苷酸的甲基化谱ABCG2公司（上面板）年CpG岛基因组图ABCG2公司CpG位点及其在ABCG2公司CpG岛（−599至+329）由顶部的垂直线表示。核苷酸位置相对于公布的DNA序列（GenBank登录号AF151530）中定义的主要转录起始位点（+1）进行编号（4）。（下面板）单个CpG二核苷酸的甲基化状态。每个细胞系面板顶部的编号栏表示本研究分析的核苷酸−440到+154的594 bp区域。编号栏上的CpG位点根据其在ABCG2公司基因组序列，为了简单起见，它们被均匀隔开。PCR产物A（−440到−193）、B（−213到+6）和C（−11到+154）是从亚硫酸氢盐处理的DNA中扩增出来用于测序的，如图所示。对每个细胞系中每个PCR片段的八个克隆进行分析。每个方块表示从UOK121、UOK143和UOK181扩增的PCR片段上的CpG位点。填充正方形，甲基化；开放式正方形，非甲基化。
图4。
图4。
甲基化沉默ABCG2公司-瞬时转染测定中的启动子报告子构建体。（A） 5′删除的示意图ABCG2公司-启动子结构。每个结构体相对于转录起始位点的5′端（箭头）被指明。与假定的CpG岛对齐在删除构造的上方。（B） 完全甲基化ABCG2公司限制性分析显示启动子-pGL3报告子构建。模拟甲基化（M。新加坡证券交易所I−）和甲基化（M。新加坡证券交易所当胞嘧啶甲基化（HpaII和HhaI）时，两种甲基化敏感的限制性内切酶的混合物无法切断其识别序列，从而对I+）结构体进行双重消化。当完全甲基化的结构物未被消化时，模拟甲基化的构造物被广泛消化，与未消化的构造物相比，产生了几个小片段。（C）ABCG2公司瞬时转染模拟甲基化或M。新加坡证券交易所I-甲基化ABCG2公司描述了启动子结构。平均报告活动±标准偏差（萤火虫/雷尼利亚荧光素酶单位[RLU]），来自三个独立的实验。pGL3-Basic表示不带ABCG2公司启动子插入。−1662至−629ABCG2公司启动子结构不包含假定的CpG岛。
图5：。
图5：。
ABCG2公司与未甲基化的细胞系相比，甲基化的细胞系中的染色质与较少乙酰化但较多甲基化的组蛋白H3（K9）相关。（上面板）使用UOK121、UOK143和UOK181细胞进行ChIP。乙酰化和甲基化H3组蛋白（K9）与ABCG2公司用PCR分析启动子。凝胶电泳显示，免疫沉淀中使用的可溶性染色质的典型大小为<0.5 kb。输入，免疫沉淀前从裂解液中分离出的DNA；IgG、ChIP使用正常IgG进行免疫沉淀；分别为1、2和3、UOK121、UOK143和UOK181。（下面板）乙酰化或甲基化H3对ABCG2公司UOK细胞中的启动子（P3区）。结果表示为免疫沉淀（IP）占总输入DNA使用量的百分比。误差条显示了独立染色质制备的三个不同实验的标准偏差。
图6。
图6。
ABCG2公司基因去甲基化后，染色质富含乙酰化组蛋白。（A） 组蛋白H3（K9）乙酰化和三甲基化富集ABCG2公司染色质。用5-氮杂-dC（1μM）处理UOK121、UOK143和UOK181细胞4天或脱肽（2 ng/ml）加维拉帕米（5μg/ml）处理24小时进行ChIPABCG2公司用PCR分析启动子。a、 b和c分别代表无治疗、5-氮杂-dC治疗和去硫肽-plus-verapamil治疗。底部面板显示了乙酰化H3或甲基化H3对ABCG2公司UOK细胞中的启动子（P3和远端区域）。结果表示为免疫沉淀（IP）占总输入DNA使用量的百分比。误差条显示了三个独立实验的标准偏差。（B） 乙酰-H3和HDAC-1的免疫印迹分析。5-Aza-dC并没有改变组蛋白乙酰化水平，而脱肽对HDAC的抑制导致全细胞裂解物中H3的超乙酰化。两种治疗均未显著影响HDAC1的表达。从UOK121、UOK143或UOK181细胞制备全细胞裂解物，分别用于乙酰化组蛋白H3（17 kDa）和HDAC-1（65 kDa）检测。
图7。
图7。
甲基化的ABCG2公司启动子与MBD蛋白相关。（A） UOK细胞系中MBD蛋白（MBD2和MeCP2）、HDAC1和mSin3A的免疫印迹分析。β-肌动蛋白作为负荷对照。在用5-氮杂-dC或脱肽处理的细胞中，MBD2、MeCP2、HDAC1和mSin3A的蛋白表达水平没有改变。（B） ChIP分析靶向P3和ABCG2公司使用MBD2和MeCP2抗体在UOK121、UOK143和UOK181细胞中启动子。1、2和3分别代表UOK121、UOK143和UOK181。（C） 针对GAPDH公司使用MBD2或MeCP2抗体的UOK细胞中的启动子。GAPDH公司没有与之关联的MBD2或MeCP2。
图8。
图8。
5-Aza-dC处理导致甲基化的MBD、HDAC1和mSin3A释放ABCG2公司发起人。针对P3和远端区域进行ChIP分析ABCG2公司使用MBD2、MeCP2、HDAC1或mSin3A抗体，用5-氮杂-dC（1μM）治疗4天后，或用脱肽（2 ng/ml）加维拉帕米（5μg/ml）治疗1天后，UOK121、UOK143和UOK181细胞中的启动子。a、 b和c分别表示无治疗（无Tx）、5-氮杂-dC治疗和脱肽治疗。底部面板显示了MBD2、MeCP2、HDAC1和mSin3A对ABCG2公司UOK细胞中的启动子（P3和远端区域）。结果表示为免疫沉淀（IP）占总输入DNA使用量的百分比。误差条显示了三个独立实验的标准偏差。
图9：。
图9：。
5-Aza-dC处理抑制了三种已知的甲基转移酶（DNMT1、DNMT3a和DNMT3b），导致它们与ABCG2公司发起人。（A） UOK细胞系中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的免疫印迹分析。β-肌动蛋白作为负荷对照。5-氮杂-dC处理（4天）可显著降低DNMT的蛋白表达水平，但不受脱肽处理的影响。（B） 针对肿瘤近端P3区域的ChIP分析ABCG2公司使用DNMT1、DNMT3a和DNMT3b抗体在UOK121、UOK143和UOK181细胞中启动子。1、2和3分别代表无治疗（无Tx）、5-氮杂-dC治疗和去肽类-葡聚糖-维拉帕米治疗。（C） 近端DNMT1、DNMT3a和DNMT3b占用率的定量分析ABCG2公司UOK细胞中的启动子（P3）。结果表示为免疫沉淀（IP）占总输入DNA的百分比。误差条显示了三个独立实验的标准偏差。
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