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.2006年11月1日；312(18):3620-30.
doi:10.1016/j.yexcr.2006.08.003。 Epub 2006年8月10日。

β-catenin中的酪氨酸残基654和670在调节Met-beta-catenin相互作用中至关重要

曾刚 1, 乌达扬·阿普特, 阿曼达·米塞尼, 亚伦·贝尔, 萨塔珊·普斯·蒙加
附属公司

β-catenin中的酪氨酸残基654和670在调节Met-beta-catenin相互作用中至关重要

曾刚等人。 Exp单元Res. .

摘要

β-儿茶素是经典Wnt途径的关键成分，也受到酪氨酸磷酸化的调节，酪氨酸磷酸化调节其与E-钙粘蛋白的结合。此前，我们报道了其与膜上的肝细胞生长因子（HGF）受体Met的结合。HGF诱导β-连环蛋白的Met-beta-catenin解离和核移位，这是酪氨酸磷酸化依赖性的。在这里，我们通过选择性地突变β-连环蛋白中的几个酪氨酸残基（单独或组合），进一步研究了Met-beta-catenin相互作用。将突变体亚克隆到FLAG-CMV载体中，并稳定转染大鼠肝癌细胞，然后用HGF处理。除同时影响654和670的突变（Y654/670F）外，所有单或双突变转染细胞均继续显示HGF诱导的FLAG-β-catenin核移位，这与HGF处理后β-catentin-TCF复合物和DNA合成缺乏一致。此外，Y654/670F转染细胞对HGF也没有表现出β-catenin磷酸化或与Met分离。因此，β-连环蛋白中完整的654和670酪氨酸残基在HGF介导的β-连环蛋白易位、活化和有丝分裂中至关重要。

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数字

图1
图1
人β-连环蛋白基因（CTNNB1）质粒构建及酪氨酸残基突变。编码由781个残基组成的人类β-catenin蛋白整个区域的CTNNB1 cDNA的示意图。核苷酸+211至+2556）插入多个克隆位点(巴姆HI）p3XFLAG-CMV™-10表达载体中CMV启动子下游，标记为WT-β-catenin质粒。对其进行定点突变，产生6个单残基控制突变体（酪氨酸转谷氨酸）：Y86E、Y142E、Y604 E、Y654E、Y670E和Y709E；4个单残基突变体（酪氨酸到苯丙氨酸）：Y86F、Y142F、Y654F和Y670F；和3个双突变体（酪氨酸到苯丙氨酸）：Y142F/Y654F、Y142F/W670和Y654F/Y670F。核苷酸变化为：酪氨酸到苯丙氨酸-TAT/TAC到CAG；酪氨酸到谷氨酸-TAT/TAC到GAG，均显示为小阴影框。
图2
图2
使用FLAG抗体检测FLAG-β-catenin，并根据HGF（50 ng/ml，持续15分钟）的反应，改变细胞中FLAG-？catenin的核水平。A.FLAG-β-catenin（~100 kDa）在FLAG-标记WT或突变的β-catentin转染细胞的全细胞裂解液中检测到。B.使用核蛋白的蛋白质印迹表明，只有Y86E、Y142E、Y654E和Y670E突变体在没有HGF的情况下存在FLAG-β-catenin蛋白。在WT-、Y604E-和Y709E转染细胞中观察到HGF诱导的FLAG-β-catenin核移位。在Y86F、Y142F、Y654F、Y670F、Y142.654F和Y142F/670F细胞中观察到核FLAG-β-catenin对HGF的反应增加，而在Y654F/Y670F细胞中没有观察到。
图3
图3
使用FLAG抗体的免疫荧光显示，除Y654/Y670F突变体外，所有酪氨酸到苯丙氨酸突变体中β-连环蛋白（绿色）对HGF的反应都发生了核移位。（400倍）。（A） -WT-β-catenin转染细胞显示无HGF的核β-catening缺失；（B） -HGF诱导这些细胞的核移位；（C）-Y86E无HGF时观察到核FLAG-β-catenin；（D） -Y142E；（F） -Y654E和；（G） -Y670E细胞，（E）-Y604E和（H）-Y709E转染细胞中无核FLAG-β-catenin；Y86F细胞无HGF时无核FLAG-β-catenin（I）；Y142F-细胞（K）；Y654细胞（M）；Y670F-电池（O）；Y142/654F-电池（Q）；Y142/670F（南）；或Y654/670F-电池（U）。HGF处理Y86F细胞后检测核FLAG-β-catenin（J）；Y142F细胞（L）；Y654F-细胞（N）；Y670细胞（P）；Y142/654F-细胞（R）；或Y142/670F电池（T）；（五） -Y654/670F细胞中存在HGF时，核FLAG-β-catenin缺失。（−）：无HGF；（+）使用HGF。
图4
图4
统计分析显示，除Y654/670F转染细胞外，显示核FLAG-β-catenin对HGF反应的细胞数量显著增加（p<0.001）。A.WT-、Y86F-、Y142F-、Y654F-和Y670F-转染细胞经HGF处理后，显示FLAG-β-catenin的细胞核数量显著增加。B.WT-、Y142/654F-和Y142F/670F-转染细胞经HGF处理后，细胞核数量显著增加，显示FLAG-β-catenin。在Y654F/Y670F转染细胞中，无论是否存在HGF，细胞核均未显示FLAG-β-catenin。
图5
图5
HGF处理后，Y654F/Y670F转染细胞的DNA合成缺乏增加。A.HGF治疗后，WT-β-catenin转染细胞和Y86E-、Y142E-、Y654E-和Y670E-转染细胞的胸腺嘧啶掺入显著增加。在Y604E和Y709E转染细胞中，在没有HGF的情况下没有观察到这种增加。B.HGF治疗后，WT-、Y86F-、Y142F-、Y654F-和Y670F-细胞的胸腺嘧啶掺入显著增加（p<0.001）。C.经HGF处理后，WT-、Y142/654F-和Y142/670F-转染细胞的胸腺嘧啶掺入显著增加（p<0.001），而Y654/670F-转导细胞的胸腺嘧啶掺入保持不变。
图6
图6
转染Y654/670F的HGF治疗后，Met/β-catenin联合或β-catentin酪氨酸磷酸化无变化。用抗FLAG抗体免疫沉淀WT或双突变转染细胞的总细胞裂解液，并对Met、E-cadherin或PY20进行印迹。A.典型的western blot分析显示，WT-、Y142/654F-和Y142/670F-转染细胞对HGF的反应中Met-β-catenin共沉淀减少，而Y654/670F-细胞无明显变化。在所有细胞中观察到E-钙粘蛋白-β-连环蛋白结合的差异较小。此外，磷酸化酪氨酸抗体检测到HGF处理后WT-、Y142/654F、Y142/770F细胞中的β-连环蛋白酪氨酸磷酸化，而Y654/670F细胞中未检测到。western用抗FLAG抗体证实了FLAG-β-catenin在所有条件下的相对下拉。B.对三份研究的代表性分析表明，除Y654/670F转染细胞外，所有细胞中Met-β-catenin联合减少3-5倍。C.HGF治疗后，所有细胞中的E-钙粘蛋白-β-连环蛋白相关性均出现了小幅度但持续的下降，范围为15-30%。D.除Y654/670F转染细胞外，所有细胞对HGF的反应中均观察到PY20-FLAG-β-catenin增加2.5–4.0倍。
图7
图7
EMSA显示HGF处理后Y654/670F转染细胞中缺乏β-catenin-TCF复合物的形成。在没有（1）或存在（2）HGF的情况下培养的WT或双突变转染细胞的10μg核提取物检测β-catenin-TCF（cyclin-D1）结合。在WT-、Y142/654F-和Y142/670F-转染细胞中观察到β-连环蛋白-TCF复合物对HGF的反应，并成功与冷探针竞争（3）。HGF处理后，Y654/670F转染细胞中未观察到复合物。
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