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.2006年9月；80（18）：9192-9。
doi:10.1128/JVI.00555-06。

原型沙粒病毒淋巴细胞脉络膜脑膜炎病毒核蛋白对Ⅰ型干扰素反应的抑制作用

路易斯·马丁内斯·索布里多 1, 艾琳娜·苏尼加, 德布雷·罗萨里奥, 阿道夫·加西亚·萨斯特雷, 胡安·卡洛斯·德拉托雷
附属公司

原型沙粒病毒淋巴细胞脉络膜脑膜炎病毒核蛋白对Ⅰ型干扰素反应的抑制作用

路易斯·马丁内斯·索布里多等。 J维罗尔. 2006年9月.

摘要

原型沙粒病毒淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒（LCMV）是研究病毒免疫学、病毒持续性和相关疾病的一匹强大的战马。LCMV的研究揭示了病毒避免被宿主适应性免疫反应消除的基本机制。在本研究中，我们表明，LCMV还通过干扰β-干扰素（IFN-beta）的产生来抑制宿主的天然防御，以应对不同的刺激，包括仙台病毒感染和脂质体介导的DNA转染。早期阻断IFN调节因子3（IRF-3）激活途径导致LCMV感染细胞中IFN生成受到抑制。这种缺陷在LCMV治愈的细胞中得到恢复，表明一个或多个LCMV产品负责抑制IRF-3的激活。使用编码单个LCMV蛋白的表达质粒，我们发现LCMV核蛋白（NP）的表达足以抑制IFN的产生和IRF-3的核转位。据我们所知，这是首次证明干扰素在沙粒病毒科家族中可对抗病毒蛋白。沙粒病毒NP对干扰素产生的抑制可能是体内毒力的决定因素。

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数字

图1。
图1。
在A549/LCMV-Pi细胞中，I型干扰素的诱导受到抑制。（A） LCMV在A549细胞中的持久性。用LCMV感染A549细胞（MOI为0.1），72小时后传代细胞建立持续感染株（A549/LCMV-Pi）。（i） 分别用IF和感染中心试验评估A549/LCMV-Pi细胞中表达病毒抗原和携带感染病毒的细胞数量。如前所述，确定了感染中心（IC）的百分比（11）。（ii）通过使用NP探针的Northern印迹测定病毒RNA的水平，以检测S RNA（复制）和NP mRNA（转录）。MB，亚甲蓝染色检测28S rRNA。（B）用2μg空pC质粒（2，32）模拟转染A549或A549/LCMV-Pi细胞（Tx-）或转染（Tx+）。转染后2小时，细胞感染NDV-GFP（MOI of 2）（+），并在24小时p.i.时评估GFP表达。作为对照，A549细胞用500 IU/ml人干扰素β（huIFNβ）（+）处理。（C） 用来自A549细胞或用空质粒模拟转染或转染的A549/LCMV-Pi细胞的TCS处理Vero细胞（12小时）。处理过的Vero细胞被表达GFP的VSV感染（MOI为1）。用人干扰素-β处理A549细胞的TCS作为对照。稀释，稀释。（D） LCMV感染治愈的细胞恢复了其产生I型IFN的能力，以应对LF介导的DNA转染。（i） RB治疗治愈LCMV感染的细胞特征。Ag+，抗原阳性。（ii）用空质粒模拟转染或转染A549、A549/LCMV-Pi和RB处理的A549/LCMV-Pi。转染16小时后，细胞感染NDV-GFP（MOI of 2），GFP表达在未感染的24小时p.i.UNF测定。
图2。
图2。
在A549/LCMV-Pi细胞中，抑制了SeV介导的ISRE启动子激活以及IFN和ISG的诱导，但不抑制IFN-β诱导的抗病毒状态。（A） 用1μg ISRE-CAT报告质粒（+）转染A549和A549/LCMV-Pi细胞。转染后，细胞被模拟感染（−）或感染SeV（+）。20小时后，准备细胞裂解物进行CAT分析。（B，C）A549、A549/LCMV-Pi和RB处理的A549/LCMV-Pi细胞被模拟感染（−）或感染SeV（+）。在24小时p.i.时，分离总RNA，并使用特定引物（如下所示）进行定量RT-PCR，以确定IFN-βmRNA（B）以及MxA、IFI56K和RIG-i mRNA（C）的水平。（D） LCMV在A549细胞中的持续存在并不能阻止I型干扰素诱导的抗病毒状态。用人干扰素β（huIFNβ）（0、10、100和1000 U/ml）处理A549和A549/LCMV-Pi细胞。IFN治疗24小时后，分离总RNA，并通过qRT-PCR测定MxA和IFI56K的mRNA水平。RT是用随机六聚体作为引物进行的。用于qPCR的基因特异性引物如下：IFN-β（sense，5′-GTCAGAGTGGAATCCTAAG-3′；antisense，5′-ACAGCATCTGCTGGTTGAAG-3′）；Mx1（正，5′-CGTGTGATTGAGAAGAGAGA-3′；反，5′-TGCAGAGGAGCGATTCGTG-3′）；RIG-I（正义，5′-AAGCCTTGGCATGTTACAC-3′；反义，5′-GGCTTGGATGGTGGTTACT-3′）；IFI56K（正义，5′-TCGGAAAGGCATGATC-3′；反义，5′-GACCTGTCTCACAGAGTC-3′）；和肌动蛋白（正义，5′-ACTGGAACGGTGAAGGTGAC-3′；反义，5′-GTGGGAGAGGACTG-3′）。
图3。
图3。
LCMV NP抑制SeV介导的IFN-β、ISRE和IRF启动子的激活。将细胞（293T）与0.5μg不同的报告质粒以及4μg指示的LCMV表达质粒共转染（+），24小时后，将细胞模拟感染（−）或用SeV感染（+）。每天24小时测定CAT（A和B）、荧光素酶（C）和GFP（D和E）的表达。
图4。
图4。
在LCMV NP转染的细胞中，SeV介导的IFN-β和ISRE启动子的激活受到抑制。293T细胞按照图3图例所述进行转染，但使用在IFN-β（IFN-βmRFP-CAT）或ISRE（ISRE mRFP-CAT）启动子下与CAT融合的单体红色荧光蛋白。20小时后，细胞被模拟感染（−）或感染SeV（+），16小时后，通过荧光和CAT分析评估报告启动子的激活。（A） 用表观荧光显微镜检测单体RFP的表达。（B） 与用空（E）对照质粒转染的未感染细胞的值相比，正常CAT表达水平显示为诱导的变化。
图5：。
图5：。
NDV-GFP生物测定。图4所示转染和感染293T细胞的上清液经过紫外线处理，并添加到新鲜Vero细胞中。16小时后，细胞感染NDV-GFP（MOI为2），在24小时p.i.时，通过外荧光检测GFP的表达。
图6。
图6。
在LCMV-PI和LCMV-NP转染细胞中IRF-3的核转位均受到抑制。（A） 用GFP标记的IRF-3（1μg）和4μg所示的LCMV表达质粒共同转染Vero细胞。20小时后，细胞被模拟感染或感染SeV，并于16h p.i.通过表观荧光评估GFP标记的IRF-3的核移位。（B） 用GFP标记的IRF-3转染LCMV持续感染细胞（LCMV-Pi）和对照Vero细胞，24h后，细胞模拟感染或感染SeV。在p.i.16小时，我们测定了模拟感染或感染SeV的LCMV-Pi Vero细胞中GFP-IRF3核移位的细胞百分比。
图7。
图7。
LCMV蛋白的表达不能阻止干扰素诱导的抗病毒状态。用2μg所示表达质粒转染Vero细胞，24小时后，用人干扰素-β（1000 U/ml）处理细胞。IFN治疗24小时后，用NDV-GFP感染细胞。使用阴性对照品（空质粒）和阳性对照品（Nipah W）验证该分析。其他对照包括未经人干扰素β（1000 U/ml）处理（−IFN）或预处理（+IFN）的Vero细胞（顶面板）。−Tx，未转染细胞。
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参考文献

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