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.2006年11月；17(11):4593-605.
doi:10.1091/mbc.e06-05-0377。 Epub 2006年8月16日。

线粒体裂变蛋白hFis1需要内质网通道来诱导凋亡

艾米莉·阿利罗尔 1, 多米尼克·詹姆斯, 丹尼斯·胡贝尔, 安德烈亚·马切托, 洛多维卡·维尔加尼, Jean-Claude马蒂诺, 卢卡·斯科拉诺
附属公司

线粒体裂变蛋白hFis1需要内质网通道来诱导凋亡

艾米莉·阿利罗尔等。 分子生物学细胞. 2006年11月.

摘要

线粒体分裂确保细胞分裂期间的细胞器遗传并参与凋亡。裂变蛋白hFis1通过引起线粒体细胞色素c的释放，触发caspase依赖性细胞死亡。这里我们表明hFis1诱导的线粒体裂变在遗传学上与凋亡不同。在缺乏多域促凋亡Bcl-2家族成员Bax和Bak（DKO）的细胞中，hFis1导致线粒体断裂，但没有引起细胞器功能障碍和凋亡。类似地，hFis1膜间区的一个突变导致了裂变，但没有导致细胞死亡，进一步将线粒体碎片从凋亡诱导中分离出来。选择性纠正DKO细胞的内质网（ER）缺陷恢复了hFis1的杀伤，表明hFis1的死亡依赖于细胞凋亡的内质网途径。hFis1并没有直接激活BAX和BAK，而是诱导Ca（2+）依赖性线粒体功能障碍。因此，hFis1是一种双功能蛋白，独立调节线粒体断裂和ER介导的凋亡。

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数字

图1。
图1。
线粒体分裂和凋亡所需hFis1结构域的突变分析。（A） 本研究中使用的结构动画。（B） 与所示质粒和mtRFP共转染的wt-MEF中线粒体形态的代表性图像。转染48小时后，通过共焦显微镜观察mtRFP的荧光。棒材15，μm。（C） 线粒体形状的形态计量学分析。实验完全按照A进行。数据表示五个不同实验的平均值±SE。（D） 删除第一个α螺旋和K148R点突变可消除hFis1诱导的细胞凋亡。将wt-MEFs与GFP和指示质粒共转染，48 h后通过流式细胞术检测凋亡率为GFP阳性、Annexin-V阳性细胞的百分比。数据表示六个独立实验的平均值±SE。
图2。
图2。
hFis1不会改变线粒体融合。（A） 聚乙二醇诱导细胞融合后异多核体的典型图像。与mtYFP或mtRFP共转染的MEF和所示质粒在玻璃盖玻片上共染，融合，并在所示时间固定。图中显示了具有代表性的多核体的共焦图像。棒材，20μm。（B） 定量hFis1的wt和突变体对线粒体PEG融合分析的影响。按照A中的方法进行实验，并在指定的时间固定细胞。线粒体融合评估如材料和方法从30个随机选择的多核体中。数据表示三个不同实验的平均值±SE。
图3。
图3。
hFis1在DKO MEF中触发线粒体分裂而非凋亡。（A） wt和DKO细胞线粒体形态的代表性图像。wt和DKO MEF与所示质粒和mtRFP共转染。实验完全按照图1所示进行。（B） 线粒体形状的形态分析如图1所示。数据表示五个不同实验的平均值±SE。（C） hFis1不会触发DKO细胞中的细胞死亡。所示基因型的MEF与GFP和所示质粒共转染。细胞凋亡测定如图1所示。数据表示六个不同实验的平均值±SE。
图4。
图4。
DKO细胞对hFis1诱导的线粒体功能障碍具有抵抗力。（A和C）采集序列5（5′）和40 min（40′）时wt（A）和DKO（C）细胞中TMRM荧光强度的伪彩色编码代表性图像。与GFP共转染的MEF和所示质粒（星号）在24小时后加载TMRM并成像。在序列的第3分钟添加寡霉素（2.5μg/ml）。（B和D）wt（B）和DKO（D）MEFs中线粒体区域TMRM荧光变化的定量。实验分别以A和C进行。量化程序在材料和方法如图所示，添加寡霉素（2.5μg/ml）和FCCP（4μM）。
图5。
图5。
表达hFis1细胞的线粒体呼吸、超微结构和ATP酶活性。（A） 对照组和表达完整重量MEF的hFis1的耗氧量。转染48小时后，收集细胞，108细胞在HBSS中孵育到氧电极室中。如图所示（箭头所示），解偶联剂FCCP（2μM）和复合IV抑制剂NaN三添加（10 mM）。（B） 对照组和表达hFis1的渗透MEF的耗氧量。除了细胞（108)在含有0.01%（wt/vol）洋地黄素的0.5 ml EB中培养。如图所示（箭头所示），谷氨酸盐加苹果酸盐（G/M，5/2.5 mM）或琥珀酸盐（Succ，5 mM，存在2μM鱼藤酮，复合物I抑制剂）、ADP（100μM）、寡霉素（2.5μG/ml）、FCCP（60 nM）和NaN三添加（1 mM）。（C） F1-ATP酶的In-gel活性测定。从hFis1转染细胞和未转染细胞中分离线粒体，并在n个-十二烷基麦芽糖苷。然后，按照实验程序所述，用BN-PAGE分离溶解样品。然后对蓝色天然凝胶进行组织化学染色，以检测ATP水解活性。将从人类炉床样品中分离的线粒体作为对照。（D） hFis1表达细胞线粒体的典型超微结构。将转染hFis1的细胞固定，并按所述获取标准电子显微镜图像。条形，100 nm。
图6。
图6。
hFis1不会激活BAX和BAK。（A） hFis1诱导细胞色素释放c（c）.wt MEF与mtRFP和所示质粒共转染。24小时后，固定细胞并进行细胞色素免疫染色c（c）以及mtRFP和细胞色素的共焦图像c（c）被收购。图像代表了三个独立实验中80个不同的细胞。棒材，15μm。（B） hFis1不会触发BAX插入线粒体膜。纯化的线粒体（50μg）与p7/p15 BID或r-HisFis1孵育。然后用0.1 M Na处理线粒体2一氧化碳三通过离心分离耐碱（颗粒）和敏感组分（上清液）。蛋白质通过SDS-PAGE分离，并使用所示抗体进行免疫印迹。（C） hFis1不会诱导BAK齐聚。纯化的线粒体（50μg）在A中孵育，蛋白质在双马来酰亚胺基己烷（BMH，10 mM）孵育15分钟后交联。用SDS-PAGE分离样品，并用抗BAK抗体进行免疫印迹。Asterisk，BAK多聚体；箭头，BAK单体。（D） hFis1在体内不会触发BAX激活。用指示的质粒转染MEF，转染细胞48小时后用BAX-NT抗体对Tom20和活化BAX进行染色，并用FITC-和TRITC-结合的同型二级抗体进行反染色。（E） hFis1在体内不会触发BAK激活。wt-MEF与所示质粒和mtYFP共转染。48小时后，用单克隆抗BAK抗体对细胞进行固定和免疫染色，并用TRITC结合的二级抗体进行复染。棒材，15μM。
图7。
图7。
BAX，BAK ER网关通过hFis1控制死亡。（A） hFis诱导的凋亡在DKO-SERCA中恢复，但在DKO-mtBAX MEF中没有恢复。所示基因型的MEF与GFP和所示质粒共转染。流式细胞术检测GFP阳性细胞和Annexin-V阳性细胞的凋亡率。数据表示六个不同实验的平均值±SE。（B） 低细胞外钙抑制hFis1诱导的细胞死亡2+]和NAC。将wt MEFs转染为A，4 h后将NAC（2.5 mM）添加到培养基中。转染48小时后监测细胞凋亡。如有指示（0.1 mM Ca2+)，wt MEF在添加EGTA的KRB中培养3小时，然后在含有0.1 mM Ca的完整DMEM中保持2转染前。
图8。
图8。
hFis1引起的线粒体功能障碍由通透性转换介导。（A和B）hFis1在DKO-SERCA MEFs中诱导线粒体功能障碍。与GFP共转染的DKO-SERCA MEFs和所示质粒（A中的星号）装载TMRM，并按照图3所示进行荧光成像。数据表示三个独立实验的平均值±SE。CsA和NAC抑制hFis1诱导的（C和D）线粒体功能障碍。与GFP和Myc-hFis1共同转染的wt MEF（C中的星号）在2.5 mM NAC或1.5μM CsA存在时加载TMRM。如图3所示，对线粒体区域的TMRM荧光进行成像、存储和分析。如有指示（B和D中的箭头），则添加寡霉素（2.5μg/ml）和FCCP（4μM）。数据代表五个不同实验的平均值±SE。（E） YFP-表达wt MEF的细胞分选。转染YFP-hFis1（YFPFis）、mtYFP或mtYFP+hFis1后20小时K148R公路（财政部K148R公路)，重量MEF（108)按照材料和方法图中显示了对照（顶部面板）和转染（底部面板）细胞中YFP荧光的点图直方图。R2表示已排序的人口。在RIPA缓冲液中裂解分选的细胞，用SDS-PAGE分离等量的蛋白质（40μg），并用指示的抗体进行免疫印迹。（F） 线粒体钙潴留能力（CRC）的代表性痕迹。排序（5×106)在实验缓冲液中用洋地黄素（0.001%wt/vol）和钙使细胞渗透2+在钙的荧光变化后测量摄取2+指示灯Ca-Green。如图所示（箭头），5μM Ca2+已添加。最终体积，1 ml，pH 7.4，37°C。（G） 洋地黄渗透细胞线粒体CRC的定量分析。与F中所示质粒转染的分选wt MEF线粒体的CRC精确测量。数据表示五个不同实验的平均值±SE。
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