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.2006年10月；3(10):793-5.
doi:10.1038/nmeth929。 Epub 2006年8月9日。

随机光学重建显微镜（STORM）的亚衍射极限成像

迈克尔·J·鲁斯特 1, 马克·贝茨, 庄晓伟
附属公司

随机光学重建显微镜（STORM）的亚衍射极限成像

迈克尔·J·鲁斯特等。 Nat方法. 2006年10月.

摘要

我们开发了一种基于光开关荧光团高精度定位的高分辨率荧光显微镜方法。在每个成像周期中，只有一小部分荧光灯被打开，从而可以以纳米精度确定它们的位置。从一系列成像周期中获得的荧光团位置用于重建整体图像。我们展示了20纳米的成像分辨率。这种技术原则上可以达到分子尺度的分辨率。

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数字

图1
图1
带有光开关荧光团的随机光学重建显微镜（STORM）。(一)该图显示了一个STORM成像序列，该序列使用一个假想的六聚体物体，标记有红色荧光团，可以分别通过红色和绿色激光在荧光和暗态之间切换。所有荧光团首先通过强红色激光脉冲切换到暗态。在每个成像周期中，使用一个绿色激光脉冲仅打开一小部分荧光团，以获得一组光学可分辨的活性荧光团。接下来，在红色照明下，这些分子发出荧光，直到它们被关闭，从而可以高精度地确定它们的位置（用白色十字表示）。然后根据从多个成像周期获得的荧光团位置重建整体图像。(b条)DNA上的一个Cy5开关在被永久性光漂白之前可以开启和关闭数百个周期。红色激光器（633 nm，30 W/cm2)用于激发Cy5的荧光（黑线）并将Cy5切换到暗状态。绿色激光器（532 nm，1 W/cm2)用于使Cy5返回荧光状态。红线和绿线交替表示激光激发模式。Cy5的回收率主要取决于Cy3的接近程度。
图2
图2
每个开关周期中单个开关的高定位精度定义了STORM的固有分辨率(一)单开关周期内DNA单开关发射的点扩散函数（PSF）。将PSF拟合为二维高斯函数（未显示）可给出PSF的质心位置。(b、 c（c）)在之前的20个连续成像周期中确定的单个开关的质心位置(b条)以及之后(c（c）)校正样本漂移。比例尺：20纳米。(d日)质心位置标准偏差的直方图。标准偏差确定为（σx个+ σ年)/使用20个成像周期的每个交换机2个，其中σx个和σ年是中质心位置的标准偏差x个和年尺寸。此直方图由29个开关构成。
图3
图3
STORM可以以亚衍射分辨率解析结构。(一)STORM清晰地解析了双链DNA上轮廓长度为46 nm的两个开关。STORM图像显示了两组清晰分离的测量开关位置簇（交叉），每个簇对应一个开关。每个簇的质量中心位置用红点标记。对于这三个示例，交换机间距离分别为46 nm、44 nm和34 nm。比例尺：20 nm。(b条)比较使用STORM（灰柱）测量的交换机间距离和考虑DNA灵活性的预测距离分布（蓝色虚线）。(c（c）)连接在双链DNA上的四个开关的STORM图像，以46纳米的等高线长度成对分开。测量的开关位置通过自动算法进行聚类（见在线补充方法），不同的聚类用不同的符号表示。比例尺：20 nm。(d日)RecA包被环状质粒DNA的STORM图像。顶部面板显示了由全内反射显微镜拍摄的带有开关标记二级抗体的间接免疫荧光图像。底部面板是相同灯丝的重建STORM图像。比例尺：300 nm。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

中的注释

  • 单分子山产生纳米级细胞图像。
    莫纳WE。 莫纳WE。 自然方法。2006年10月；3(10):781-2. doi:10.1038/nmeth1006-781。 自然方法。2006 PMID：16990808 免费PMC文章。
  • 光的极限。
    舒尔特A。 舒尔特A。 Nat Rev Mol细胞生物学。2010年10月；11(10):678. doi:10.1038/nrm2989。 Nat Rev Mol细胞生物学。2010 PMID：20861874 没有可用的摘要。

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参考文献

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