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.2006年8月1日；20（15）：2041-54。
doi:10.1101/gad.388706。

组蛋白三甲基化与trxG和PcG蛋白维持转录ON和OFF状态

伯纳黛特·帕普 1, 于尔格·米勒
附属公司

组蛋白三甲基化与trxG和PcG蛋白维持转录ON和OFF状态

伯纳德特·帕普等。 基因开发. .

摘要

Polycomb group（PcG）和trithorax group（trxG）蛋白作为拮抗调节物，维持HOX和其他靶基因的转录OFF和ON状态。为了研究PcG/trxG控制的分子基础，我们分析了发育中果蝇纯化的Ubx（OFF）和Ubx细胞中HOX基因Ultrabithorax（Ubx）的染色质。我们发现PcG蛋白复合物PhoRC、PRC1和PRC2以及Trx蛋白在OFF和ON状态下都与Polycomb响应元件（PRE）组成结合。相反，trxG蛋白Ash1仅在ON状态下结合；不是在PRE而是转录起始位点的下游。在OFF状态下，我们发现整个Ubx基因在H3-K27、H3-K9和H4-K20处发生广泛的三甲基化；即，整个上游控制区、启动子区和编码区。在ON状态下，上游控制区也在H3-K27、H3-K9和H4-K20处三甲基化，但启动子和5'编码区中都没有这三个修饰。我们对缺乏PcG组蛋白甲基转移酶（HMTase）E（z）或trxG HMTase Ash1的突变体的分析提供了强有力的证据，证明启动子和编码区的组蛋白赖氨酸三甲基化差异导致了Ubx的转录ON和OFF状态。特别是，我们的结果表明，预醚化PcG蛋白复合物长距离作用产生Pc抑制的染色质，该染色质在H3-K27、H3-K9和H4-K20处三甲基化，但trxG HMTase Ash1选择性地阻止启动子和编码区在ON状态下的三甲基化。

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数字

图1。
图1。
(A类)三龄幼虫的想象盘果蝇属幼虫，用Ubx蛋白抗体染色（红色）。在野生型中，超双胸在翼（W）盘（以白线标记的盘轮廓）中不表达，但在haltere（H）和third-leg（L）影像盘的所有细胞中高水平表达。(B)地图超双胸qPCR扩增基因座和基因组区域F1–F22。在优步，PCR片段的位置及其与超双胸转录起始位点（箭头）以千碱基（kb）表示；粗黑线表示编码区域。标有PBX的盒子，bxd公司PRE、BXD和bx公司PRE表示已知顺式-监管要素超双胸（详见正文）。这个bxd公司PRE、超双胸发起人bx公司PRE和国际建筑协会-7PRE输入阿卜杜勒-B图2、3、4、5、6中以蓝色突出显示了相应的PCR片段，以便于参考。常色（euchr）F19–F21和异色（het）F22控制区域显示在正确的。有关引物对的准确位置，请参见SOM5。
图2。
图2。
PhoRC、PRC1和PRC2在PREs.X-ChIP对野生型机翼（黑条）和haltere/第三翼（橙色条）的成像盘进行的分析表明超双胸关闭和超双胸打开染色质。每个图表显示了至少三个独立的免疫沉淀反应的结果，这些反应是使用针对所示PcG蛋白的抗体进行的。X-ChIP信号水平表示为每个区域沉淀的输入染色质的百分比。区域编号如图1B所示，并显示了简化地图以供参考。PhoRC亚基Pho和dSfmbt；PRC1亚基Ph、Psc、Pc和Sce/环；和PRC2亚单位Su(z（z）)12和Pcl在bxd、bx，和国际建筑协会-7两者中的PRE超双胸关闭和超双胸打开染色质。请注意，Ph在两种染色质的启动子处也以可比较的水平结合。然而，还要注意，在约束级别方面存在细微差异。首先，所有PRC1和PRC2亚单位在bx公司PRE大约减少了两倍超双胸打开染色质与超双胸关闭染色质。第二，在Ubx、，PRE外Pc的低水平结合至少比控制区F19–F21高出三倍，但在启动子和编码区F9–F12中降低超双胸打开染色质。免疫前血清的结果见SOM1。
图3。
图3。
Trx组成性地结合在PRE和启动子上，而Ash1选择性地结合在活性蛋白的5′编码区超双胸基因。对野生型机翼（黑条）和haltere/third-leg（橙色条）影像盘进行X-ChIP分析，分析方式与图2所示实验相同。Trx在bxd、bx、，和国际建筑协会-7PREs和Ubx启动子超双胸关闭和超双胸打开染色质。Ash1在F10特别绑定，从超双胸转录起始位点，但仅在超双胸打开染色质。注意，其他区域（即PRE）的Ash1信号并不显著高于对照区域F19–F22。
图4。
图4。
Ubx基因的组蛋白图谱。对野生型机翼（黑条）和haltere/third-leg（橙色条）影像盘进行X-ChIP分析，分析方式与图2所示实验相同。组蛋白H3、H4和H1在整个超双胸除PRE（F4、F5、F13和F18）和启动子（F9）外的基因，在这两个位置组蛋白信号都减少超双胸关闭和超双胸打开染色质；详见正文。
图5。
图5。
差异化H3-K27、H3-K9和H3-K4三甲基化由PcG和trxG HMTases控制。(A、 左)对来自野生型的翅膀（黑条）和头骨/第三头骨（橙色条）影像盘的X-ChIP分析(顶部行），灰烬122/灰烬122(中间的行），以及E（z）61/E（z）61(底部行）动物的表现方式与图2所示的实验相同。E（z）61纯合子在18°C（允许温度）下完成胚胎发育，然后在30°C（限制温度）下饲养96（-120）h。值得注意的是，X-ChIP信号没有标准化到组蛋白水平；PRE组蛋白信号减少超双胸需要考虑图4所示的启动子。在野生型动物中，H3-K4me3(左上角)在转录起始位点和活性蛋白下游1 kb（F9–F10）高度富集超双胸haltere/third-leg椎间盘基因；考虑F9处H3信号降低（图4）。在野生型动物中，H3-K27me3和H3-K9me3信号在整个超双胸非活性位点（F1–F17）超双胸翅盘中的基因，但这两种信号在活性的启动子和编码区（F8-F17）都非常强烈地减少超双胸笼头/第三足椎间盘中的基因。注意，H3-K9me3（而非H3-K27me3）在异色控制区F22中高度富集。在灰烬1负极突变动物H3-K4me3信号在haltere/third-leg影像盘中严重减少，而H3-K9me3和H3-K27me3信号则在haltere/third-leg影像盘中的启动子和编码区（F8–F17）中强烈增加，在那里它们达到了与翼盘相当的水平。在E（z）负极突变体，H3-K4me3信号位于转录起始位点和下游1kb（F9–F10），不仅存在于haltere/third-leg中，也存在于翼盘中。注意启动子中的H3-K27me3和H3-K9me3信号以及E（z）负极变异的翼盘。这个E（z）61本实验中使用的等位基因不是零突变，观察到的H3-K27me3信号可能是由于不完全破坏E（z）活动（见正文和SOM2）。(赖特)来自野生型的机翼（W）和吊带（H）/第三左腿（L）影像盘，灰烬122/灰烬122,或E（z）61/E（z）61用于X-ChIP的幼虫用Ubx蛋白抗体染色。在haltere/third-leg光盘中灰烬122纯合子，～80%的细胞显示Ubx蛋白信号丢失。在翼盘中E（z）61纯合子，高水平的错误表达超双胸在～20%的细胞中检测到；在haltere/third-leg盘中，Ubx信号与野生型幼虫的信号相当。尺寸较大的灰烬1突变的haltere盘可能反映了部分转化为翼盘。E（z）61如果幼虫在上述限制温度下生长，纯合子翅盘和缰盘通常比野生型盘小。(B、 C类)H4-K20me3、H3-K9me2和H4-K20me1的存在乌兹别克斯坦。对野生型机翼（黑条）和haltere/third-leg（橙色条）影像盘进行X-ChIP分析，分析方式与图2所示实验相同。H4-K20me3剖面与H3-K27me3和H3-K9me3剖面非常相似；注意，启动子和编码区的H4-K20me3信号在ON状态下减少。H3-K9me2在异染色质控制区F22强烈富集，但在Ubx和其他控制区未检测到显著富集。H4-K20me1在超双胸打开染色质和仅检测到H4-K20me1信号的背景水平超双胸关闭染色质。
图6。
图6。
转录器组分的差异结合。对野生型机翼（黑条）和haltere/third-leg（橙色条）影像盘进行X-ChIP分析，分析方式与图2所示实验相同。TBP、Spt5和Kismet均在PRE中绑定超双胸关闭和超双胸打开染色质；这种结合的意义尚不清楚，但请注意所有三种蛋白质在启动子和编码区的差异结合。在启动子区，F9、TBP和Spt5都在活性和非活性处结合超双胸基因，但请注意，在不活跃状态下，结合水平大约低三倍超双胸启动子。另请注意，在编码区域F10–F17中，Spt5仅存在于超双胸打开染色质，可能反映了拉长RNA Pol II复合物的存在。在启动子（F9）处，Kismet仅与超双胸打开染色质和未检测到结合超双胸关闭染色质；我们还检测到3′编码区F16中的Kismet结合超双胸打开染色质。
图7。
图7。
PcG和trxG蛋白复合物结合和组蛋白甲基化的示意图超双胸基因处于OFF和ON状态。PhoRC、PRC1、PRC2和Trx在bxd公司和bx公司PREs和Trx、TBP和Spt5在转录起始位点附近组成性结合。PRC1和PRC2结合水平在bx公司在ON状态下的PRE和在OFF状态下转录起始位点TBP和Spt5结合水平的降低由较小的符号表示。请注意，Ash1仅在转录起始位点下游1 kb处的ON状态下结合。还要注意，Kis在转录起始位点的结合仅在ON状态下观察到。为简单起见，未显示TBP、Spt5和Kis在其他站点（即PRE）的绑定。在OFF状态下，H3-K27、H3-K9和H4-K20三甲基化存在于整个Ubx基因中。在ON状态下，H3-K27、H3-K9和H4-K20三甲基化存在于整个上游控制区，但在启动子和编码区中基本不存在，而H4-K20me1和H3-K4me3则存在。
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