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.2006年8月9日；25(15):3565-75.
doi:10.1038/sj.emboj.7601245。 Epub 2006年7月27日。

印迹的Air-ncRNA是一种非典型的RNAPII转录物，可以避免剪接并逃避核输出

克里斯汀·塞德尔 1, 斯特凡·H·斯特里克, 丹尼斯·巴洛
附属公司

印记的Air ncRNA是一种非典型的RNAPII转录物，可以逃避剪接和核输出

克里斯汀·塞德尔等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

Air ncRNA的表达对于沉默印迹Igf2r簇中顺式的多个基因是必要的。然而，其作用方式未知。在这里，我们描述了Air的共转录和转录后特征，这些特征将其确定为核调节RNA类的新成员。我们证明，Air是通过RNA聚合酶II（RNAPII）从DNA甲基化敏感启动子转录而来的。然而，尽管与其他RNAPII转录物类似，它被封端并被聚腺苷酸化，但大多数Air转录物逃避共转录剪接，从而产生成熟的108 kb ncRNA。因此，成熟的未剪接Air是核定位的，高度不稳定。这些特征表明，Air是一种非典型RNAPII转录物，其特性表明其在基因沉默中的作用模式可能不依赖于RNA本身，而是与其实际转录相关。

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数字

图1
图1
这个空气ncRNA基因和启动子。(A类)显示位置和方向的地图空气与侧翼基因相关的ncRNA。这个空气发起人位于免疫球蛋白2r内含子2和最后的3′末端Mas1型内含子。箭头：表达基因；P： 父系等位基因；M： 母体等位基因；*:空气启动子。(B类)发起人组织空气.条纹表示空气CpG岛(http://www.ebi.ac.uk/prumps/cpgplot/)，T1–3：转录开始；SD：如图5所示的剪接供体位点。AP1、AP2、SP1、Myc、GC-box（GCB）和TATA序列的共识位点。(C类)稳态水平免疫球蛋白2r和空气用探针F3B测定细胞和成年小鼠的RPA(空气)，EX46/47(免疫球蛋白2r)：1：探针+酵母RNA−RNase；2：尺寸标记；3：探针+酵母RNA+RNase；4：成人大脑；5：成人肝脏；6：成人肾脏；7：成人肺；8：成人心脏；9:NIH3T3。CypA基因（装载控制）。*未消化探头。(D类)QPCR（带q-assay空气中间）显示不同空气成年小鼠肾脏（Ki）、成年小鼠心脏（He）、小鼠胎盘（Pl）11.5 dpc和16.5 dpc的转录水平。空气四个生物复制品的转录水平标准化为18秒rRNA和肾脏中的水平设置为1；条形图下方的数字表示与肾脏相关的转录水平。IE：压印表情；BE：双等位基因表达；NE：未表示。
图2
图2
这个空气ncRNA启动子被DNA甲基化抑制。的表达式免疫球蛋白2r（如48所示），空气（q如是说空气中间），免疫球蛋白2（q如是说免疫球蛋白2)和H19型（q如是说H19型)用qPCR对一窝含有一个野生型（WT）、六个杂合子和三个纯合子的E9.5胚胎cDNA进行了检测，结果表明，一窝胚胎的cDNA中含有1个野生型，6个杂合子和3个纯合子Dnmt1型零突变（Li等, 1993). 单独分析单个胚胎的RNA，并用于计算标准偏差。值规格化为Gapdh公司。WT和杂合子胚胎的结果相似，并合并为1。免疫球蛋白2r和免疫球蛋白2mRNA显示减少Dnmt1型空胚分别为0.26和0.02（箭头）。空气和H19型ncRNAs的富集度分别为2.89和2.54。
图3
图3
这个空气ncRNA是一种RNAPII转录物。(A类)暴露于α-amanitin（α-am）的NIH3T3细胞的RNA印迹。来自对照（−）和中毒（+）细胞的总细胞RNA与RNAPII转录物杂交Myc公司和RNAPIII转录本5秒RNA（探针在补充数据中列出）。三个生物复制品中的一个在24小时时表现出抑制RNAPII转录，但不抑制RNAPIII转录。28S和18秒rRNA带显示为负载控制，因为RNAPI不受α-am的影响(B类)空气用qPCR（q-assay）分析表达空气中间）标准化为18秒rRNA显示减少空气在所有三个生物复制品（BR）中表达。未经处理的对照设置为100%。
图4
图4
这个空气ncRNA具有7mGcap。(A类)用cap特异性抗体H20对RNA免疫沉淀（IP）进行qPCR。用qPCR对生物复制2（BR2）、上清液（SN）、第一次洗涤（1W）、第五次洗涤（5W）和抗体结合RNA（IP）的四个组分的RNA进行了分析空气（白色条，q-assay空气中间），免疫球蛋白2r（浅灰色条，q-assay ex48）和18秒（深灰色条，q-assay 18S）。SN分数设置为1，其他分数显示为相对富集/还原。箭头表示可忽略的值。(B类)上清液中IP RNA与RNA的比率（IP/SN）显示为空气和免疫球蛋白2r三个生物复制相对于相同的比率18秒rRNA。(C类)用于监测与Sepharose G-beads非特异性结合的无抗体珠（Mock-IP）的控制反应。(D类)IP与相同同型的无关抗体（IgG-IP）一起用于确定RNA与IgG表位的非特异性结合。
图5
图5
空气降低了拼接潜力。(A类)显示相对位置的地图空气,免疫球蛋白2r和Mas1（Mas1）。以下所示为全长未拼接空气和五组剪接变异体（SV1、SV1a、SV2、SV3、SV4），它们在转录起始下游53bp共享相同的5′-剪接供体。黑条：外显子；灰线：内含子；用于qPCR的引物（一个正向引物（FP）与不同的反向引物（RP）组合）和Taqman探针（TP）的位置如下所示。(B类)拼接汇总空气在数据库中找到EST克隆(网址：www.ensembl.org和http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST网站).n个：克隆数；bp：SV长度；代表：%重复次数由确定http://www.repeatmasker.org/; ORF：最长开放阅读框的长度。(C–G类)qPCR分析显示相对表达水平（归一化为亲环素q）塞浦路斯ex3/4）在未切割的成年小鼠组织中空气5′）和拼接（D-G q表示SV1、SV1a、SV2、SV3）空气ncRNA。Te：睾丸；Br：大脑；Ki：肾脏；Lu：肺；他：心。(H（H）)用RPA分析从细胞系和组织中制备的RNA，探针MlMs1跨越多个空气显示剪接和未剪接的转录起始位点空气抄本。1：尺寸标记；2：探针+酵母RNA−RNase；3：探针+酵母RNA+RNase；4:Thp/DB104 MEF；5:DB104/Thp MEF；6:MEFF Thp/+细胞；7:NIH3T3细胞；8:野生型小鼠的成年心脏。母体等位基因写在左侧。有关单元的详细信息，请参见材料和方法。无片断开始转录空气：T1、T2和T3；用于拼接空气：SVT1、SVT2和SVT3。SVT2和SVT3的保护带在原始曝光中可见。使用车道4中星号标记的带空气是未插片的23–44%空气在4、6、7和8号车道。
图6
图6
未分割的空气ncRNA不输出到细胞质。核（N）、细胞质（C）和总细胞（T）RNA的qPCR分析。条形图显示标准化为CypA基因总RNA（T）中的值设置为1（星号）。亲环素(CypA基因)是已知的细胞质mRNA。其他细胞质mRNAs的分布与CypA基因N和C组分中无富集。(A类)控制RNA的分布。Gapdh公司（q如是说Gapdh公司ex5）显示N和C相对于CypA基因（q如是说CypA基因ex3/4），位于细胞质中；45秒前rRNA（q-assay45秒前RNA）显示N/C比为342/1和901/1，位于细胞核中；H19型ncRNA（q-assay）H19型)显示N/C比值为0.9/1和1.1/1，位于细胞质中。(B类)未分割的分布空气（q如是说空气中间）显示出30/1和80/1的N/C比，并且位于细胞核中。免疫球蛋白2r（q-assay ex48）显示N/C比率为2.4/1和2.1/1，并输出到细胞质，但也存在于细胞核中。(C类)B组分析样品的RNA印迹显示Gapdh公司,CypA基因,Myc公司,免疫球蛋白2r,空气（补充数据中列出的探针）和rRNA（亚甲基蓝染色）。(D类)空气剪接变异体被输出到细胞质并显示出类似于免疫球蛋白2r（q-assay SV1:6.8/1和6.4/1；q-assage SV1a:3.0/1和2.4/1；q-assey SV2:3.0/1和2.8/1；q-assay SV3:2.8/1和2.2/1）。
图7
图7
全长空气是不稳定的转录本。(A–C)暴露于10μg/ml放线菌素D（ActD）的NIH3T3的RNA印迹。显示了来自3个生物重复中的1个的一组代表性印迹。从对照（−）和中毒（+）细胞中制备总RNA，并将其杂交至Myc公司（A） ，免疫球蛋白2r（B） 和Gapdh公司（C） ●●●●。探针列在补充数据中。Myc公司mRNA在2小时后耗尽，而免疫球蛋白2r和Gapdh公司ActD治疗8h后，mRNA水平无变化。(D类)qPCR检测空气（q如是说空气中间）和免疫球蛋白2r（q as say ex48）转录本使用A–C组中分析的RNA样本。每个值都标准化为Gapdh公司（q如是说Gapdh公司例5）（最长8小时）或18秒rRNA（q-assay 18S）（最长48小时）。对照组未处理样品设置为100%，ActD样品显示为对照组的%。数值平均三个生物复制，每个复制在技术副本中进行。为这些结果计算了一个单相指数衰减曲线，半衰期值由Prism4计算（跨度=100，平台=0，k个⩾0）未拼接空气2.1小时（黑色三角形），免疫球蛋白2r14.3 h（黑色正方形）、SV1 15.4 h（浅灰色三角形）和SV3 16.7 h（深灰色三角形）。(E类)qPCR分析的稳定性空气,免疫球蛋白2r和西斯特（q-assay Xist）与原代E13.5 dpc细胞的RNA进行比较。按照面板D进行分析；半衰期：空气1.6小时（黑色三角形），免疫球蛋白2r14.3小时（黑色正方形），西斯特4.6小时（浅灰色方形）。
图8
图8
TI模型空气ncRNA-介导的基因沉默。显示了11.5 dpc胎盘的表达模式（注意这是唯一表达的胚胎组织Slc22a2系列和第22a3页). 在父系染色体上空气ncRNA（带虚线的RNAPII）预计会干扰RNAPII与免疫球蛋白2r启动子，并干扰表达Slc22a2系列和Slc22a3系列基因。在母体染色体上空气启动子被卵母细胞中获得的DNA甲基化印记预先沉默。RNAPII可以访问免疫球蛋白2r启动子和结构域调节蛋白结合蛋白（DR-BP）可以访问胎盘特异性结构域调节因子并激活第22页和Slc22a3系列基因（条纹箭头）。领域监管机构被设想为顺式-作用元件，如增强子，或定义不太明确的元件，如基质附着区，甚至可能是未知元件顺式-作用元件。低稳定性空气ncRNA由新生转录物的虚线表示。
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